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Purification de l'enzyme Enzyme purification تنقية الإنزيمات


Purification des enzymes
تنقية الإنزيمات


Comme dans le cas des protéines, l’extraction et la purification des enzymes est un processus long et délicat, du fait que certaines d’entre elles sont étroitement associées aux membranes des organites cellulaires comme la membrane plasmique, les mitochondries, le réticulum endoplasmique et les chloroplastes.
Les protocoles d'extraction et de purification des enzymes reposent sur l'exploitation des différences qui existent entre les molécules extraites en termes de propriétés physiques et chimiques. Ainsi, la propriété de taille (poids) peut être exploitée pour trier les matériaux grâce à la technique de chromatographie par filtration sur gel, également appelée 'chromatographie d'exclusion'. L'exploitation de la propriété d'ionisation ou de charge électrique nécessite le recours à la chromatographie échangeuse d'ions ou à l'électrophorèse.
Les étapes d'extraction et de purification des enzymes se déroulent en milieu réfrigéré (environ + 4°C), pour que les structures fonctionnelles des enzymes (tertiaires et quaternaires) soient préservées. La première étape de l'extraction des enzymes commence par l'écrasement et le broyage du tissu contenant l'enzyme dans une solution ayant un pH, une force ionique et d'autres propriétés spécifiques, basés sur des informations préalables sur l'enzyme. Cette étape est suivie d'une centrifugation pour éliminer les matières insolubles. Cela conduit à un extrait enzymatique appelé extrait total, suivi plus tard d'un extrait brut qui combine l'enzyme avec d'autres protéines, puis d'une enzyme pure, comme le montre la figure suivante.

Enzymes. Purification

Avant les étapes de purification par chromatographie pour obtenir l'enzyme pure, une étape de précipitation est réalisée où la solubilité des molécules est exploitée. Il s'agit du traitement de l'extrait enzymatique avec du sel qui est souvent le sulfate d'ammonium, (NH4)2SO4). Ce processus entraîne une précipitation car les ions de l'électrolyte se combinent à l'eau, ce qui réduit la quantité d'eau nécessaire pour dissoudre les protéines. Cette méthode est appelée Relargage par les sels.


Enzymes. Applications
الإنزيمات. تطبيقات


عرف التحفيز البيولوجي عبر الإنزيمات العديد من التطبيقات المهمة في مختلف المجالات مما انعكس عنه النمو الإقتصادي و المحافظة عن البيئة و صحة المجتمعات. يستغل الإنسان الإنزيمات التي تحتوي عليها الكائنات الحية الدقيقة كالبكتريا و الفطريات لاستعمالها في تطبيقات نفعية للأنسان و كمثل يجدر ذكره استعمال الإنزيمات في مجالات البيوتكنولوجيات البيضاء (الكائنات الحية لإنتاج مواد كميائية مطلوبة) و الصفراء أو بيوتكنولوجيات البيئة تستعمل الإنزيمات في مجالات الكشف السريع و الدقيق. كمثل بسيط نذكر هنا تقنية الكشف عن تحلون الدم و قياس تركيز سكر الجلوكوز. يتم ذلك من خلال استعمال إنزيم نزع الهيدروجين من الجلوكوز و التقاطه من طرف الفيريسيانيد الذي يختزل ويتغير لونه بالتوازي مع وفرة الركيزة للإنزيم أي الجلوكوز


Usage des enzymes dans les bioconversions

Les enzymes interviennent dans les bioconversions qui font partie des biotechnologies blanches (white biotechnology) visant les productions industrielles. Parmi les applications commeriales des enzymes, on peut citer les productions de lessives ou détergents. Les marques de lessive les plus performantes combinent protéases, lipases, amylases et cellulases pour augmenter l'efficacité du lavage. Chacune de ces enzymes est capable d'attaquer un type particulier de tache ou de salissure. Un autre exemple d'application des enzymes concerne la fabrication de sirop de fructose à partir d'amidon provenant du maïs et où l'amylase et la glucose isomérase jouent un grand rôle. Parmi les avantages des enzymes, les taux réactionnels élevés, une fois comparés à ceux des réactions non catalysées (les enzymes sont 10 puisance 10 fois plus rapides).
Parmi les inconvéniens des enzymes, on note le coût élevé, solubilité limitée dans les solvants, dépendance aux cofacteurs et coenzymes, spécificité trop élevée et instabilité. L'utilisation des enzymes immobilisées tend à éliminer certains désavantages d'application.

enzymes immobilisées

L'un des avantages des enzymes immobilisées réside dans leur réutilisation plusieurs fois.


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Enzymes. Applications (suite)
الإنزيمات. تطبيقات


Applications des enzymes dans les analyses médicaux. Exemple d'évaluation du niveau du glucose dans le sang (Glycémie) pour tester le diabète.

La glycémie peut être testée par une réaction enzymatique. Cependant, les enzymes échangent rarement les électrons avec des électrodes. De ce fait, il est nécessaire d'utiliser un médiateur (Mediator) qui passe d'un état oxydé à un état réduit par des protons enlevé d'un autre réducteur, le glucose du sang. Plus il y'a de médiateur réduit (intensité de sa coloration), plus il y'a du glucose.
La réaction enzymatique peut être catalysée dans les conditions optimales par une enzyme comme la glucose déshydrogénase en présence d'un médiateur; le ferricyanide de potassium qui sera réduit en ferrocyanide de potassium par les protons H+ provenant du glucose du sang.

Glucose dehydrogenase
Glycémie, glucomètre

Comment convertir les concentrations du glucose de g/L en mmol/L (vidéos, Fr, Ar)


Effet de la vitamine C (acide ascorbique) sur la glycémie ?
تأثير الحمض الأسقربوتي، فيتامين، على قياس السكر في الدم


- Que pensez-vous du résultat du test de la glycémie pour un individu qui prend de la vitamine C (acide ascorbique) dont la structure est proche de celle du glucose (voir figure)?

كيف ستكون نتيجة الكشف عن تحلون الدم عند شخص يأخد فيتامين  C -الحمض الأسقربوطي ؟

GLUCOSE, ACIDE ASCORBIQUE

Link: Electrochemistry for Diabetes Management

Avertissement. Lorsqu'on utilise un système de lecture de la glycémie basé sur la glucose oxydase (gluc + O2 --> Acide gluconique + H2O2), l'acide ascorbique (vitamine C) donne un effet inverse de celui obtenu avec le système de la glucose déshydrogénase. Ainsi, avec le système glucose oxydase la vitamine C fait diminuer les résultats des tests de glycémie. En effet, en réduisant le peroxyde d'hydrogène (eau oxygénée, H2O2), l'acide ascorbique réduit le taux de H2O2 utilisé dans le système, d'où diminution des valeurs des lectures.


Effet du paracétamol sur les tests de la glycémie ?
تأثير الباراسيتامول على قياس السكر في الدم

- Aussi le paracétamol (acétaminophène), étant réducteur, il fait augmenter les valeurs des lectures de la glycémie suite à son oxydation...

Paracétamol (acétaminophène)


The mechanism of ascorbic acid interference on glucose measurements with electrochemical strips is that ascorbic acid is oxidized at the electrode surface, resulting in the production of more electrons and the generation of more current.
Also paracetamol (acetaminophen), being a reducing agent, it increases the values of blood sugar readings following its oxidation. The acetaminophen (see figure) is directly oxidized, producing an interfering current that increases the glucose reading. The oxidation by acetaminophen is thought to be related to its free phenolic hydroxyl group.


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LIENS UTILES


- Enzymologie-enzymes (exercices)
- Purification des Protéines. Exercices
- QCM-Enzymes. Structure et fonction (bases)
- Hexokinase
- Coenzyme Atransférase
- Amine oxydase
- Inhibiteurs. Applications
- QCM-Inhibiteurs-2.
- Enzymologie. Examen-1
- Enzymologie. Examen-2
- Enzymologie. Examen-3
- Enzymologie. Examen 4
- Enzymologie. Examen 5
- Polyphénoloxydase. Examen S5
- Phospholipase A2. Examen
- الإنزيمات. تنقية وتطبيقات- Enzymes. Purification and applications
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