Le
critère de la forme des molécules donne lieu aux techniques de chromatographie d'affinité (Affinity chromatography, كروماتوغرافيا الألفة).
Des complémentarités de forme peuvent exister entre plusieurs molécules. Il en résulte une affinité. C'est le cas des des affinités:
- Antigène-Anticorps
- Enzyme-Substrat ou Enzyme-Inhibiteur
- Recepteurs membranaires-Molécules
- Lectines-Glucides
- Acides nucléiques-Nucléoprotéines.
La chromatographie d'affinité repose sur la fixation spécifique et réversible d'une protéine à un ligand lié à la matrice. Le ligand peut soit se lier directement à la protéine d'intérêt ou à un tag qui est attaché de manière covalente à la protéine.
La chromatographie d'affinité est est une méthode de purification plus robuste. Généralement, elle est utilisée
dans les premiers stades de purification. La purification par affinité peut être la seule étape de chromatographie nécessaire pour atteindre une pureté adéquate. e
Pour la chromatographie d'affinité, la phase stationnaire est réalisée sur une matrice inerte (agarose ou polyacrylamide) fixée de manière covalente à un ligand qui se lie spécifiquement à une protéine ou un groupe de protéines (voir figure).
Il existe deux types de chromatographie d'affinité dont la chromatographie d'affinité sélective et la chromatographie d'affinité non sélective.
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Chromatographie d'affinité sélective:
un ligand spécifique d'une protéine ou d'un tag lié
de manière covalente est utilisé.
- Chromatographie d'affinité non sélective
:
comme la protéine A, G, L pour les immunoglobulines, ou de l'héparine pour des protéines liant l'ADN, ou la lectine pour les glycoprotéines, le ligand se lie à un groupe de protéines avec des capacités de liaison similaires.
En chromatographie d'affinité, les protéines sont chargées sur la colonne dans des
conditions qui influencent la liaison entre la protéine (ou tag) et son ligand.
Le lavage de la protéine liée se fait dans des conditions ne perturaent pas l'interaction spécifique, mais pouvant perturber les interactions non spécifiques entre des protéines contaminantes et la phase stationnaire.
L'élution de la protéine liée est fait avec un tampon contenant une molécule concurrente ou des conditions perturbant les interactions protéine / protéine. La molécule concurrente
se lie au ligand et déplace la protéine d'intérêt. La molécule concurrente est généralement éliminée
de la protéine d'intérêt par un autre procédé chromatographique ou par une dialyse.
Exemple d'élutions de protéines liées lors d'une chromatographie d'affinité:
| Protéine à purifier | Ligand | Eluée avec |
| Anticorps (classe-spécifique) | Protéine A, G, ou L | pH extrêmes |
| Anticorps (antigène-spécifique) | peptide antigénique | peptide libre |
| Protéine taguée avec le tag Poly histidine | Ni2+ ou Co2+ | Imidazole ou histidine libre |
| Protéine taguée avec l'épitope FLAG | Anticorps anti- FLAG spécifique | peptide FLAG ou pH faible |
| Protéine taguée avec le tag GST | glutathion réduit | glutathion libre |
| Protéine de liaison a l'ADN | Héparine | Force ionique élevée |
| Protéine taguée avec l'épitope Myc | Anticorps anti-Myc spécifique | faible pH |
Plus de détails: https://www.labome.fr/method/Protein-Purification.html
Exemple d'application de la chromatographie d'affinité. Purification de protéines recombinantes (figure).
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- Examen contrôle corrigé du module techniques analyses, FSSM, 2023
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Electrophorèse. QCM-
Techniques basées sur le(s) critère(s):
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-
Ionicité
360 pages, 2018, ISBN : 978-9920-35-345-8 + DVD mis à jour + Assistance.
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