La purification de l'ADN d'une plante a été réalisée selon le protocole utilisant le CTAB (bromure d'hexadécyltriméthylammonium) inclus dans un tampon de lyse chimique à pH basique contenant
EDTA 20 mM et NaCl 1,4 M. Après séparation par affinité aux phases suivie d'une précipitation et d'un lavage, l'ADN a été repris dans 90 µL d'eau (ADN0). Un volume de 6 µL a été utilisé pour préparer une dilution au 1/125 de ADN0 donnant l'ADN1. L'ADN non dilué
a été soumis à hydrolyse pendant 45 minutes par Hind III en présence d'une RNase. Il en résulte l'hydrolysat noté ADN+.
L'électrophorèse de l'ADN préalablement purifié
à partir de la plante, a été réalisée sur gel d'agarose 1%, tout en faisant migrer en même temps:
- Marqueurs de poids moléculaire (PM).
- Un plasmide natif extrait d'une bactérie et ayant été conservé pendant une durée déterminée
(PN).
- Plasmide natif, hydrolysé par Hind III et donnant des quantités
d'ADN de 120 ng (PH1) et 100 ng (PH2).
Après révélation du gel avec le bromure d'éthidium,
l'électrophorégramme suivant a été obtenu.
Les marqueurs de tailles de l'ADN (PM) sont constitués de 10 fragments d'ADN de tailles connues et indiquées dans le tableau suivant:
1) A l'aide de la figure ci contre, proposer l'ordre logique des étapes simulées (1 à 6) du protocole de purification de l'ADN.
a) 6 + 5 + 1 + 3 + 2 - b) 6 + 4 + 1 + 3 + 2
c) 6 + 4 + 1 + 2 + 3 - d) 6 + 5 + 1 + 2 + 3
e) 6 + 1 + 3 + 5 + 2 - f) 6 + 1 + 3 + 4 + 2
2) Citer les qualités d'une bonne purification de l'ADN
des plantes. 3) A l'aide du profil PM, tracez la courbe étalon
PM en fonction de la distance (cm). Utiliser le papier semi-log fourni.
4) Estimer les tailles en pb correspondant aux zones z1 et
z2 des profils électrophorétiques ADN0 et ADN1.
5) En s'aidant du profil ADN+, déduire à quoi
correspondent les zones z1 et z2 ?
6) Préciser le nombre de sites de restriction Hind III
portés par le plasmide hydrolysé (profils PH1 et PH2).
7) Calculer la taille de l'ADN correspondant aux fragments
révélés par électrophorèse du plasmide
hydrolysé (h1, h2, h3).
8) Calculer la taille en pb de l'ADN du plasmide.
9) A propos de l'ADN du plasmide natif.
A - Calculer les poids moléculaires apparents des ADN 1 et
2 résultant de la séparation du plasmide natif (profils
PN).
B - A quoi correspondent les bandes 1 et 2 révélées
par électrophorèse de l'ADN du plasmide natif (profils
PN).
C - Quelle est la bande qui reflète la taille du plasmide ?.
D - Quelle est la bande qui représente le plasmide coupé
sur un seul brin ?.
E - Quelle est la bande qui représente le plasmide longuement
conservé? Justifier.
10) Déterminer les quantités en ng d'ADN correspondants
aux 3 fragments de restriction du profil PH2.
11) En se référant aux profils PH1 ou PH2, estimer
la quantité en ng de l'extrait d'ADN de plante.
--> REPONSES
Biologie moléculaire, Examen. Réponses
1) Ordre logique des étapes (1 à 6) de la purification de l'ADN:/1
a): ....... b): .. X .. c): ......
d):..... e): ..... f):........
2) Qualité(s) d'une bonne purification de l'ADN./ :/1
- ADN sans protéines ni polysaccharides ni phénols (/0,5)
- ADN non altéré (hydrolysé) (/0,5)
3) A l'aide du profil PM, tracez la courbe étalon PM
en fonction de la distance (cm) :/2,5
(Tracé) /1, (Projections
z1, PN1, PN2, h1, h2, h3 et z2) /1,5
4) Estimer les tailles en pb correspondant aux zones z1 et
z2 des profils électrophorétiques ADN0 et ADN1:/1
- z1 : 9000 pb : ADN
- z2 : 200 - 500 pb : ARN
5) En s'aidant du profil ADN+, déduire à quoi correspondent les zones z1 et z2 ? :/0,5
- z1: ADN
- z2 :: ARN
6) Préciser le nombre de sites de restriction Hind III
portés par le plasmide hydrolysé (profils PH1 et PH2)
:/1
Nombre de sites de restriction Hind III : 3
7) Calculer la taille de l'ADN correspondant aux fragments
révélés par électrophorèse du plasmide
hydrolysé (h1, h2, h3). :/1
h1 : 1250 pb, h2 : 1000 pb et h3 : 600 pb
8) Calculer la taille en pb de l'ADN du plasmide. :/0,5
Taille totale : 1250 + 1000 + 600 pb = 2850 pb
9) A propos de l'ADN du plasmide natif. :/2,5
A - Calculer les poids moléculaires apparents des ADN 1 et 2 résultant de la séparation du plasmide natif (profils PN) PN 1 (2 cm) : 4500 pb ….. PN 2 (3,1 cm) : 2800 pb (/0,5)
B - A quoi correspondent les bandes 1 et 2 révélées
par électrophorèse de l'ADN du plasmide natif (profils
PN).
PN1 : Plasmide forme relâchée ……………
PN2 : Plasmide forme linéaire (/0,5)
C - Quelle est la bande qui reflète la taille du plasmide
?.
PN2 (plasmide forme linéaire) (/0,5)
D - Quelle est la bande qui représente le plasmide coupé
sur un seul brin ?.
PN1 (plasmide forme relâchée) (/0,5)
E - Quelle est la bande qui représente le plasmide longuement
conservé ? Justifier
PN2 (plasmide forme linéaire), car coupé sur les deux
brins (/0,5)
10) Déterminer les quantités en ng de DNA correspondants
aux 3 fragments de restriction du profil PH2. /1,5
- h1 représente 1250/2850 = 44% de la taille totale du plasmide,
soit 100 x 0,44 = 44 ng (/0,5)
- h2 représente 1000/2850 = 35% de la taille totale du plasmide,
soit 100 x 0,35 = 35 ng. (/0,5)
- h3 représente 600/2850 = 21% de la taille totale du plasmide,
soit 100 x 0,21 = 21 ng (/0,5)
11) En se référant aux profils PH1 ou PH2, estimer
la quantité en ng d'ADN purifié à partir de la
plante. /1,5
L'intensité de la bande z1 du profil ADN1 (ADN dilué
125 fois) est proche de l'intensité de la bande h1 du profil
PH2 (plasmide hydrolysé 100 ng). (/0,5)
Quantité d'ADN dans 6 µl : 44 ng x 125 = 5500 ng (/0,5)
Quantité dans 90 µL d'ADN purifié : (90/6) x 5500
= 82500 ng (/0,5)
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moléculaire. Examen Travaux pratique, Archives
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moléculaire. Examen écrit S4 (2011)
- Electrophorèse. QCM
- Acides
nucléiques. Contrôle écrit S4
- Extraction,
purification et électrophorèse de d'ADN de plantes.
TP S4
- Protocole
de purification de l'ADN. TP S4
- DNA electrophoresis
on agarose gel
- QCM purification ADN des
plantes (TP S4)
- Purification, analyse DNA
du plasmide. Contrôle TP 2015
- Biologie
moléculaire. Examen TP S5 2016
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