Biologie moléculaire. Analyse de l'ADN par électrophorèse (examens TP)

Biologie moléculaire, Purification et analyse de l'ADN par électrophorèse. Examens des Travaux Pratiques

Les travaux pratiques de Biologie moléculaire du semestre S4 (TP S4) couvrent l'extraction de l'ADN (DNA) à partir de 4 espèces de plantes, hydrolyser le DNA par des enzymes de restriction comme Hind III et séparation des fragments de DNA par électrophorèse sur gel d'agarose. Ce TP permet de se familiariser avec les techniques de séparation en Biochimie et l'électrophorèse, en particulier. Ici Examen de la Faculté des Sciences-Semlalia, Université Cadi Ayyad, Marrakech, Maroc

Examen TP S4 2014

( Corrections brèves)
Après électrophorèse du DNA de plasmide sur gel d'agarose 0,8% pendant 1 heure à 100V , un électrophorégramme correspondant à 4 échantillons, a été obtenu:
- Echantillon 1: Marqueurs de PM. La taille est indiquée en paires de bases (pb).
- Echantillon 2: Plasmide X natif (100 ng).
- Echantillon 3: Plasmide X (100 ng) complètement hydrolysé par une enzyme de restriction E1.
- Echantillon 4: Plasmide X (100 ng) complètement hydrolysé par une enzyme de restriction E2.
Les résultats obtenus sont montrés dans les tableaux suivants.

Marqueurs des poids moléculaires:

1/ Tracer la courbe étalon sue le papier semi-log accompagnant le texte (/4 points)
Echantillons 2, 3 et 4:

2/ Déterminer la taille des DNA correspondant à l'échantillon 2. Qu'en déduisez vous ? (/2).
bande 1: ................ - Bande 2: ............... - Déduction: ..............
3/ Déterminer la taille de DNA de l'échantillon 3. Quel est le nombre de coupures effectuées par E1 ? Qu'en déduisez vous ? (/4)
Taille du DNA: ........... - Nombre de coupures: ......... - Déduction: ..............
4/ Peut-on déterminer la taille du plasmide X par l'analyse de ces 2 résultats ? Si oui, donnez sa taille (/2,5)
Oui/Non: ........ - Taille: ...........
5/ Déterminer les tailles des DNA de l'échantillon 4. Quel est le nombre de coupures effectuées par E2 ?. Déduire la taille du plasmide X (/4).
Taille du DNA: bande 1 ........ - bande 2 ........- bande 3 ............
Nombre de coupures: ............ - Taille du plasmide X: ..............
6/ Déterminer les quantités de DNA en ng correspondantes aux 3 fragments de l'échantillon 4. Donner le détail du calcul (/3,5)

Examen TP S4 2012

--> Corrections brèves)
En cherchant un protocole expérimental adéquat pour l'extraction du DNA d'une plante, le matériel végétal (0,25 g) a été soumis à une lyse chimique en présence de 1 ml de tampon d'extraction contenant NaCl 1,4 M, EDTA, 20 mM, Tris-HCl 100 mM (pH 8,0), CTAB (bromure d'hexadécyltriméthylammonium) 0,3 M et ß-mercaptoéthanol 1% (v/v). Après une incubation de l'extrait à 65°C pendant, 20 minutes, 1 ml du mélange chloroforme-alcool isoamylique (24v :1v) a été ajouté au tube contenant l'extrait qui a été agité par inversion à la main. La centrifugation à 9000 g pendant 10 minutes a permis de former deux phases (phase supérieure et phase inférieure) séparée par une interphase. La phase devant contenir le DNA a été récupérée et le DNA a été précipité par l'isopropanol et lavé par l'éthanol 70% (v/v) avant d'être séché et conservé dans 50 µl d'eau distillée.
Afin d'estimer la quantité de DNA extrait de la plante selon le protocole expérimental suivi, un ADN de référence, représenté par un plasmide natif (PlX) préalablement hydrolysé par l'enzyme de restriction Hind III, a été utilisé pour évaluer la quantité de DNA par comparaison des intensités des bandes révélées après éléctrophorèse sur gel d'agarose par incubation en présence du Bromure d'éthidium (Bet). L'hydrolyse du plasmide natif PlX (200ng) par l'enzyme de restriction Hind III a été réalisée à 37°C pendant une d'incubation de 60 minutes. Avant l'électrophorèse sur gel d'agarose à 0,8% (p/v), un volume de 3 µl de tampon de charge 10x (contenant le bleu de bromophénol et le saccharose 1,5 M) a été ajouté à tous les tubes correspondant à l'extrait d'ADN préparé, le PlX natif et le PlX hydrolysé. Les quatre puits suivants ont été utilisés.

- puits N°1 : marqueurs de poids moléculaires (250 à 10000 pb)
- puits N°2 : Extrait d'ADN purifié à partir du matériel végétal
- puits N°3 : plasmide X natif (200 ng)
- puits N°4 : plasmide X natif (200 ng) hydrolysé par Hind III
Les résultats obtenus, correspondant à des bandes révélées sur le gel d'agarose, sont consignés dans les 4 tableaux suivants :
- puits N°1 (Marqueurs de poids moléculaires):

Questions
1) Rappeler les rôles de EDTA, CTAB et pH basique dans l'extraction de l'ADN.
2) Que contiennent l'interphase et la phase aqueuse formées après addition du mélange chloroforme-alcool isoamylique suivi d'une centrifugation.
3) Citer le(s) critère(s) moléculaires exploité(s) dans la séparation de l'ADN du plasmide par éléctrophorèse sur gel d'agarose
4) Quels sont les rôles des éléments composant le tampon de charge ajouté aux extraits avant leur séparation par électrophorèse ?
5) Rappeler le principe de révélation (mise en évidence) des acides nucléiques par le bromure d'éthidium.
6) A l'aide du profil éléctrophorétique du puits 1, tracez la courbe étalon log PM = f(distance).
7) Estimer les tailles en pb des zones E1 et E2 révélées par le bromure d'éthidium après séparation sur gel d'agarose de l'extrait d'ADN du matériel végétal ? A quoi correspondent -elles ?
8) Quelles conclusions, peut-on tirer sur le protocole expérimental appliqué dans l'extraction de l'ADN du matériel végétale ?
9) Calculer la taille de l'ADN correspondant aux bandes révélées par électrophorèse De l'ADN du plasmide natif. A quoi correspondent-elles ?
10) Calculer la taille de l'ADN correspondant aux bandes révélées par électrophorèse De l'ADN du plasmide hydrolysé.
11) Calculer la taille en pb de l'ADN du plasmide PlX
12) Quelle conclusion déduisez-vous des tailles des ADN séparés par électrophorèse et correspondant aux puits 3 (plasmide natif) et 4 (plasmide hydrolysé).
13) Déterminer les quantités en ng de DNA correspondants aux 3 fragments de restriction obtenus concernant le profil éléctrophorétique du puit N°4 (plasmide hydrolysé).

Examen TP 2009

(Corrections brèves)

La figure ci dessous représente l'électrophorégramme obtenu après migration des échantillons 1, 2 et 3 sur un gel d'agarose horizontal à 0,7% (p/v) pendant 10 heures à 50 Volts:

- Echantillon N° 1: marqueurs de poids moléculaires. La taille est indiquée en paires de bases (pb).
- Echantillon N° 2: plasmide pLX (50 ng) complètement hydrolysé par l'enzyme de restriction Hind III.
- Echantillon N° 3: plasmide plX (150ng) à l'état natif (non hydrolysé).
1/ Tracer la courbe étalon (4 points)
2/ Déterminer la taille des DNA correspondants aux bandes E, F et G (3 points)
3/ En déduire la taille de PlX (1 point)
4/ Que représentent les bandes A, B et C ? (3 points)
5/ Déterminer la taille de PlX à partir du profile N° 3. Qu'en déduisez-vous (3 points)
6/ Pouvez-vous déterminer la quantité en ng de DNA correspondant aux trois fragments E, F et G ? (6 points)

Examen TP 2014. Réponses ---> Retour aux questions de l'examen 2014

1) Tracer la courbe étalon:

Axes : d (cm), log PM (pb).
Titre : Courbe étalon log PM en pb en fonction de la distance de migration en cm.
Droite : La droite correcte doit passer entre d= 6 cm (1000 pb) et d= 1,8 cm (8000 pb).
2) Déterminer la taille des DNA correspondant à l'échantillon 2. Qu' en déduisez vous ?
- Bande 1 : 7000 pb - Bande 2 : 4300 pb
- Déduction : La bande 1 correspond à la forme relachée du plasmide natif; la bande 2 correspond à la forme super-enroulée du plasmide natif.
3) Déterminez la taille du DNA de l'échantillon 3. Quel est le nombre de coupure effectuée par E1 ? Qu' en déduisez vous ?
4) taille du DNA : d = 2,4 cm, 6000 pb
5) Nombre de coupure : 1
6) Déduction : la coupure unique de E1 a linéarisé le plasmide X.
4) Peut -on déterminer la taille du plasmide X par l'analyse de ces deux résultats ? si oui donnez sa taille.
oui /0,5 - Taille : 6000 pb
5) Déterminez la taille des DNA de l'échantillon 4. Quel est le nombre de coupure effectuée par E2. Déduire la taille du plasmide X.
Taille du DNA : bande 1: 3100 pb, bande 2 : 2000 pb, bande 3 : 1000 pb
Nombre de coupure : 3
Taille du plasmide X : 3100 + 2000 + 1000 = 6100 pb
(Ces tailles sont à déduire de la courbe.
6) Déterminez la quantité en ng de DNA correspondant aux trois fragments de l'échantillon 4. Donner le détail du calcul:
- Fragment 1:
6000 pb ------> 100%
3000 pb ------> x= 50% Fragment 1 : 50ng
- Fragment 2:
6000 pb-------> 10O%
2000 pb-------> 33,33% Fragment 2: 33,33ng
- Fragment 3:
6000 pb-------> 100%
1000 pb-------> x= 16,66% fragment 3: 16,66ng

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1) Rappeler les rôles de EDTA, CTAB et pH basique dans l'extraction de l'ADN.
- EDTA: chélate les éléments Mg++ qui activent les DNases (lien EDTA)
- CTAB: détergent cationique (+) formant complexe avec ADN et aidant à détacher les protéines. Les détergent coupent les liaisons hydrophobes
- pH basique: permet de charger les protéines (histones) négativement (-) et crée répulsion de charges éléctriques entre histones et ADN.
2) Que contiennent l'interphase et la phase aqueuse formées après addition du mélange chloroforme-alcool isoamylique suivi d'une centrifugation.
- Interphase: contient des protéines, polysaccharides, phénols, ..
- Phase aqueuse: contient ADN + ARN
3) Citer le(s) critère(s) moléculaires exploité(s) dans la séparation de l'ADN du plasmide par éléctrophorèse sur gel d'agarose.
- Taille des molécules
- Forme des molécules (exemples ADN relaché, ADN superenroulé).
La charge électrique (-) des acides nucléiques n'est pas déterminante dans la séparation.
4) Quels sont les rôles des éléments composant le tampon de charge ajouté aux extraits avant leur séparation par électrophorèse ?
- Bleu de bromophénol: permet de suivre visuellement la migration
- Saccharose: permet de rendre les extraits d'ADN denses pour faciliter leur dépôt dans les puits
5) Rappeler le principe de révélation (mise en évidence) des acides nucléiques par le bromure d'éthidium.
Le bromure d'éthidium (Bet) s'intercale dans l'ADN et permet de voir des bandes transparentes à l'obscurité, une fois excité avec des rayons UV.
6) A l'aide du profil éléctrophorétique du puits 1, tracez la courbe étalon log PM = f(distance).

7) Estimer les tailles en pb des zones E1 et E2 révélées par le bromure d'éthidium après séparation sur gel d'agarose de l'extrait d'ADN du matériel végétal? A quoi correspondent -elles ?
- Zone E1: taille 8000-10000 pb. Elle correspond à l'ADN
- Zone E2: taille 300-500 pb. Elle correspond à l'ARN
8) Quelles conclusions, peut-on tirer sur le protocole expérimental appliqué dans l'extraction de l'ADN du matériel végétale ?
Le protocole expérimental ne permet pas d'avoir de l'ADN pure, car il reste associé à l'ARN. D'où la nécessité d'utiliser un traitement avec une RNase.
9) Calculer la taille de l'ADN correspondant aux bandes révélées par électrophorèse De l'ADN du plasmide natif. A quoi correspondent-elles ?
- Band N1: 7000 pb. Elle correspond au 'plasmide relaché'
- Bande N2: 6000 pb. Elle correspond au 'plasmide à ADN linéaire'
- Bande N3: 3250 pb. Elle correspond au 'plasmide superenroulé'
10)Calculer la taille de l'ADN correspondant aux bandes révélées par électrophorèse De l'ADN du plasmide hydrolysé.
- Band H1: 3000 pb.
- Band H2: 2000 pb.
- Band H3: 1000 pb.
11) Calculer la taille en pb de l'ADN du plasmide PlX
Taille du plasmide = 3000 + 2000 + 1000 = 6000 pb
12) Quelle conclusion déduisez-vous des tailles des ADN séparés par électrophorèse et correspondant aux puits 3 (plasmide natif) et 4 (plasmide hydrolysé).
La taille du plasmide (6000 pb) correspond à la taille de la forme linéaire (bande N2), située entre la forme relachée et la forme superenroulée).
13) Déterminer les quantités en ng de DNA correspondants aux 3 fragments de restriction obtenus concernant le profil éléctrophorétique du puit N°4 (plasmide hydrolysé).
Tailletotal du plasmide = 6000 pb correspondant à 200 ng
Bande H1: taille 3000 pb correspondant à 100 ng
Bande H2: taille 2000 pb correspondant à 66,67 ng
Bande H3: taille 1000 pb correspondant à 33,33 ng
Total: 100 + 66,6 + 33,3 = 200 ng

Réponses brèves, examen 2009
-->Retour aux questions de l'examen 2009

1/ Courbe étalon
Courbe marqueurs moléculaires, TP

2/ Déterminer la taille des DNA correspondants aux bandes E, F et G (3 points)
E: 4000 pb, F: 1500 pb, G: 1000 pb
3/ En déduire la taille de PlX (1 point)
Taille de PlX = E+F+G = 6500 pb
4/ Que représentent les bandes A, B et C ? (3 points)
A: Forme circulaire relachée
B: Forme linéaire (intermédiaire)
C: Forme circulaire superenroulée.
5/ Déterminer la taille de PlX à partir du profile N° 3. Qu'en déduisez-vous (3 points)
PlX: B linéaire a une distance de migration égale à 2,2 cm. Cela correspond à 6500 pb. La taille réelle correspond à la forme linéaire (bande B). Ceci est en corrélation avec la taille du plasmide trouvée en faisant la somme E+F+G
6/ Pouvez-vous déterminer la quantité en ng de DNA correspondant aux trois fragments E, F et G ? (6 points)
E = 50 ng x 4000/6500 = 30,77 ng
F = 11,54 ng
G = 7,7 ng

LIENS UTILES

- Biologie moléculaire. Examen Travaux Pratiques (TP) S5 (2018-19)
- Biologie moléculaire. Examen écrit S4 (2011)
- Electrophorèse. QCM
- Acides nucléiques. Contrôle écrit S4
- Extraction, purification et électrophorèse de d'ADN de plantes. TP S4
- Protocole de purification de l'ADN. TP S4
- DNA electrophoresis on agarose gel
- QCM purification ADN des plantes (TP S4)
- Purification, analyse DNA du plasmide. Contrôle TP 2015
- Biologie moléculaire. Examen TP S5 2016

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