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L'extraction et purification de l'acide désoxyribonucléique (ADN, DNA) est une étape importante dans l'étude de cette molécule porteuse de l'information génétique.
Elle nécessite 3 étapes importantes, dont 1) une action physique, consistant à détruire les structures cellulaires (paroi cellulaire, en particulier) par broyage mécanique, réalisé souvant en présence de l'azote liquide, 2) une action chimique (lyse chimique) tendant à solubiliser les composantes biochimiques du tissu et 3) Une purification (isolation) de l'ADN des autres molécules biologiques comme les protéines, les polysaccharides et les composés phénoliques.
Sur la même page: Extraction de l'ADN -- Electrophorèse de l'ADN -- Vidéos sur l'extraction et l'électrophorèse de l'ADN du palmier dattier -
Extraction de l'ADN
Comme il est réalisé dans les séances des travaux pratiques (TP) du quatrième semestre (S4) de la filière licence science de la vie de la Faculté des Sciences de Marrakech (Université Cadi Ayyad, Maroc), les étudiants font l'extraction et la purification de l'ADN à partir de 4 espèces de plantes (chou-fleur, chou, courgette et courge rouge).
Se renseigner du rôle de toutes les composantes du tampon d'extraction et de prification de l'ADN (Ar, Fr)
L'électrophorèse reste l'outil le plus important dans l'analyse qualitative (voir même quantitative) des acides nucléiques (ADN, ARN). Son principe doit être bien compris. Les critères de séparation utilisés sont la taille (poids moléculaire) et l'ionicité (charge électrique). Comme les acides nucléiques sont chargés négativement (grâce au phosphate), le critère de la charge électrique n'est pas comptabilisé dans la séparation (toutes les molécules migrent dans la même direction, +) et les fragments de l'ADN sont séparés uniquement en fonction du poids moléculaire.
L'analyse des acides nucléiques (en particulier l'ADN) par électrophorèse consiste d'abord à lui faire subir un traitement préalable correspondant de deux natures dont 1/ coupure (restriction) par une ou plusieurs enzymes de restriction (technique RFLP) et 2/ amplification de certains fragments (ou régions) par la réaction de polymérisation en chaîne (PCR, polymerisation chain reaction). La complexité d"un génome et sa grande taille rendent impossible l'analyse directe des profils de restriction de l'ADN des eucaryotes. Ceci est dû au nombre élevé des fragments de restriction obtenus après action d'une enzyme de restriction (supérieur à 1000000). Dans la majorité des cas, le profil de restriction obtenu après révélation (ou coloration) de l'ADN montre un voile (ou continuum, smear) représentant tous les fragments de restriction tassés sur le gel (tailles faibles vers +) et difficiles à distinguer.Ce problème est résolu par recours à des techniques supplémentaires qui permettent de mettre en évidence uniquement les fragments interessant l'expérimentateur. Ceci est rendu possible par l'utilisation de sondes marquée préparée pour réagir spécifiquement avec des séquences précises à travers la technique de transfert (blotting). Pour réaliser cette tâche, il faut effectuer un transfert des bandes d'ADN du gel sur une membrane de nitrocellulose (ou nylon). Une reconstitution d'un film, de l'extraction de l'ADN à son analyse, existe sur CD.
Le support de migration le plus utilisé dans l'éléctrophorèse de l'ADN est constitué de l'agarose (0,8-1,5%, environ) suivi des gels de polyacrylamides. L'éléctrophorèse peut être réalisée horizontalement ou verticalement (avec les gels de polyacrylamide). Les étudiants déposenet de faibles volume d'ADN hydrolysé par une enzyme de restriction comme Hind III.
La révélation de l'ADN sur le gel d'agarose est réalisée par le bromure d'éthidum qui est ajouté dans le gel d'agarose à l'état liquide ou simplement en solution dans laquelle on fait incuber le gel. Les fragments d'ADN sont rendus visibles par exposition du gel aux rayons UV à l'obscurité.
Pour déterminer le poids moléculaires des fragment d'ADN séparés sur le gel d'agarose, les étudiants tracent la courbe du logarithme des poids moléculaires de fragments d'ADN de poids connus (marqueurs de PM) en fonction de la distance parcourue (ou aussi la mobilité relaive) par les différents fragments.
Vidéos du laboratoire (extraits). (ces vidéos existent aussi sous CD avec livre)
Extraction de l'ADN des folioles de palmier dattier (Video: homogénéisation du materiel végétal, déproteination, précipitation du DNA par l'alcool,...)
Amplification par PCR de l'ADN du palmier dattier (technique RAPD) (Video: préparation du mélange reactionnel contenant le DNA, l'amorce, la Taq DNA polymerase, les dXTP et les autres réctifs. Il suit la polymerisation du DNA par PCR,....)
Préparation du gel d'agarose (minigel) pour l'électrophorèse de l'ADN du palmier dattier (Video: Agarose 1% coulée dans un moule pour minigels,...)
Electrophorèse
sur gel d'agarose de l'ADN du palmier dattier, préalablement
amplifié par PCR (technique RAPD) (Video: Préparation
des échantillons, dépôt, migration et révélation
par Bromure d'Ethidium, ...)
-/ Rôle des composantes des étapes d'extraction et de purification de l'ADN
