L'électrophorèse (كهرتهجير, electrophoresis) est une technique d'analyse et de séparation basée sur les critères de la charge électrique et la taille des molécules. La migration différentielle de particules chargées électriquement, se fait sous l'influence d'un champs électrique.
Seules les particules chargées positivement ou négativement sont attirées par les pôles opposés du champs électrique. Les composés qui peuvent être transformés en particules chargées par formation de complexes, sont de même sujets à une migration sous l'effet du champs électrique. Parmi les supports utilisés dans la technique d'électrophorèse, on note le gel de polyacrylamide donnant de bonnes résolutions lors de la séparation.
Sous l'action d'un champs électrique, E, une protéine se déplace avec une vitesse, v, proportionnelle au champs:
v = µ E, avec µ appelée 'mobilité
électrophorétique' µ = v / E (1)
avec : µ en cm2.s-1.volt-1, v en cm.s-1 et E en volt.cm-1
Le champs électrique (E) crée entre 2 électrodes, exerce une force, F, sur une protéine que l'on suppose sphérique et de charge q; F = q E
Les forces de frottement, F', dues à la viscosité (eta) vont s'opposer à la migration de la protéine et la freiner;
Donc, la mobilité d'une particule
migrant dans un champs uniforme dépend de 3 facteurs : q, (eta) et r.
VOIR DEMONSTRATION
Ainsi la mobilité répond aux règles:
-Elle est proportionnelle à sa charge (q).
-
Elle est inversement proportionnelle au coefficient de viscosité du milieu , (eta)
-Elle est inversement proportionnelle à son rayon (r).
La réalisation de l'électrophorèse nécessite 3 composantes principales: 1/ Cuve d'électrophorèse qui porte le support de migration, 2/ Générateur de courant électrique continu et une cuve de révélation des produits séparés.
- Electrophorèse horizontale
- Electrophorèse verticale
Les supports utilisés en électrophorèse sont nombreux, avec des degrés de résolution variables. Leurs types ont permis de distinguer plusieurs appellations en électrophorèse, comme:
- Electrophorèse en veine liquide
- Electrophorèse sur papier
- Electrophorèse sur gels (agarose, amidon, polyacrylamide...).
يختلف وسط العزل (Support de migration) حسب نوعية الجزيئات المراد فرزها بالكهرتهجير. عند ظهور التقنية، كان في شكل سائل أو ورق، ثم تطور بعدها إلى شكل هلام (Gel) من نشا (Amidon) و أغاروز (Agarose) و بولي أكريلميد (Polyacrylamide). يمتاز كل وسط عن الآخر بالدقة في الفرز و سهولة الاستعمال. غالبا ما تستعمل مادة الأغاروز في تركبة وسط عزل الأحماض النووية، زيادة عن مادة البولي أكريلميد و الذي يستعمل بكثرة في حالة فرز البروتينات.
Comment sont formés les gels de polyacrylamide ?
Les gels de polyacrylamides sont au départ des solutions liquides constituées d'un mélange d'acrylamide et du bis acrylamide (N,N'méthylène-bisacrylamide) qui réagissent entre eux pour former un gel réticulé suite au déclenchement d'une réaction de polymérisation initiée par le persulphate (fourni par le persulfate d'ammonium) et le le TEMED (N,N,N',N'-tétraméthyléthylènediamine). Le persulfate génère en présence du TEMED le radical sulfate (S., oxydant puissant). L'acrylamide (A) possédant une double liaison entre deux carbones, constitue une cible privilégiée pour le radical sulfate. Il en résulte une molécule d'acrylamide forme radical libre (A.). Celle ci attaque à son tour une deuxième molécule d'acrylamide, pour donner un nouveau radical libre. Les radicaux libres du polyacrylamide peuvent régir entre eux pour donner des polymères d'acrylamide ou polyacrylamide (A-A-An) qui est une chaîne linéaire de forme liquide et visqueuse. Pour arriver à un support d'électrophorèse sous forme de gel solide facile à manipuler, il devient nécéssaire de faire appel à un agent réticulant (cross linker). Le bisacrylamide (équivalent de 2 monomères d'acrylamide liés par un groupement méthyl), possédant deux sites d'attaque radicalaire (2 doubles liaisons entre atomes de carbone), constitue un agent de réticulation de choix. Ainsi, Il permet la formation de ponts entre les molécules d'acrylamide. Les gels obtenus ainsi sont caractérisés par un degré de réticulation bien précis (dépendant du pourcentage du bisacrylamide).Le pourcentage C de Bis par rapport à l''acrylamide est: C = [poids (Bis)/ poids(acrylamide+Bis)]x 100.
REVELATION DES MOLECULES SEPAREE PAR ELECTROPHORESE
Afin qu'elles puissent être détectées les molécules séparées par électrophorèse doivent être révélées par coloration ou traitements appropriés pour les rendre visibles
Révélation - إستظهار.
تختلف طرق استظهار مواد الفرز فوق وسط العزل حسب أنواع الجزيئات. فيما يخص البروتينات، فإنها غالبا تلون بالملون أزق كوماسي الذي يلتصق خصيصا بكل ما هو بروتين. تستظهر الأحماض النووية فوق وسط العزل بإضافة المادة الكيميائية بروميد الإيتيديوم التي تتعرف عليه عند تسليط أشعة بنفسجية على المعقد تظهر للعين في الظلام أطراف الحمض النووي. يعطي الرسم التالي توضيحات إيضافية في استظهار البروتينات و الأحماض النووية بعد نهاية عزلهم بتقنية الكهرتهجير
Les critères moléculaires exploités dans la séparations
des protéines sont la CHARGE ELECTRIQUE
le POIDS MOLECULAIRE
et dans certaines situations la FORME (voir effet
de pH sur les formes de l'albumine). Le pH des solutions joue un rôle très important dans l'acquisition des charges électriques.
Ainsi,dans le cas des protéines, le pH auquel la charge électrique globale est nulle est appelé point isoélectrique.
Une protéine en solution portée à un pH inférieur à son PI, se comporte
comme une base et capte des protons H+. Elle devient chargée positivement.- Une protéine mise à un pH supérieur
à son PI (point isoélectrique), se comporte comme un acide et cède des protons .
Elle sera chargée négativement. VOIR LE CAS D'UN ACIDE AMINE A:
De façon plus simplifiée, la mobilité électrophorétique d'une molécule peut-être exprimée par la relation :
Mobilité = k . (pH - pI) / masse molaire
pI est le point isoélectrique de la molécule.
The larger the difference between the pI and the pH of interest, the greater the net charge on the protein.
Electrophorèse des protéines sur gel de polyacrylamide
Ce type d'électrophorèse peut être réalisé
en utilisant des systèmes tampons dissociant ou non dissociant, continus ou non continus. L'agent dissociant le plus utilisé est le détergent anionique; Sodium
Dodecyl Sulfate (SDS). Une fois fixé sur les protéines (à chaud) le SDS affecte une charge négative (-) à tous les polypeptides. Ces derniers migreront, donc, dans le gel de
polyacrylamide selon leur taille, uniquement. Ainsi, l'experimentateur peut déterminer le poids moléculaire (PM) des différents polypeptides en se référant à la mobilité
de polypeptides de PM connus (marqueurs de PM). Le système tampon non dissociant est recommandé pour l'électrophorèse de protéines natives, où l'interaction subunitaire, la conformation et l'activité biologique des protéines doivent être préservées. Dans ce cas, la séparation se fait sur la base de la charge et de la taille.Les systèmes tampons discontinus (multiphasiques) utilisent différents tampons à des pH différents.
Exemple de systèmes tampon discontinus : le système d'Ornstein.
L'utilisation de tampons discontinus dans leur pH et la nature des ions, permet la concentration préalable de l'échantillon à séparer.
Les gels de polyacrylamide répondant à cette condition, présentent 2 types de structures:
- Un gel de concentration (stacking gel).- Un gel de séparation (resolving gel).
L'utilisation en électrophorèse de gels de concentration et de séparation de concentrations en polyacrylamide non convenable peut aboutir à 2 situations différentes :
- Elimination des protéines incapables de pénétrer dans le gel, dans le cas des gels très concentrés.
- Absence de séparation des protéines de petite taille, migrant avec le front.
Entre ces 2 extrêmes, les protéines peuvent être résolues différemment selon la concentration en polyacrylamide du gel de séparation:
| (Polyacrylamide) (%) | Poids moléculaire (Kd) |
| 15-20 | 10-40 |
| 10-15 | 40-100 |
| 5-10 | 100-300 |
| 5 | 300-500 |
| 2-5 | PM>500 |
Révélation des protéines par coloration sur gel
Lorsqu'il s'agit des protéines, celles ci sont généralement incolores. Leur visualisation sur les supports d'électrophorèse s'effectue par des procédés histochimiques qui permettent de colorer les produits de dénaturation de la protéine ou une partie chimique qui lui est associée. Exemples: coloration au bleu de coomassie et coloration par nitrate d'argent.
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Révélation des protéines par mise en évidence d'une activité biologique (catalyse enzymatique)
Lorsque les protéines sont de nature enzymatique, la révélation peut être faite sur le gel par addition des substrats spécifiques d'une telle ou telle enzyme. Des exemples de gels révélés au laboratoire pour la détection du polymorphisme enzymatique (activité biologique) sont expliqués dans la partie pratique (voir TP isoenzymes).
Autres vidéos sur notre chaîne youtube: Biochimie. chaîne youtube
La révélation in situ sur gel des protéines par réaction antigène-anticorps est coûteuse, car les protéines séparées restent " emprisonnées" dans le gel. Pour diminuer les quantités les coûts d'anticorps à ajouter pour révéler les protéines, il faut éluer les protéines du gel.
Transfert des protéines préalablement séparées sur gel, sur membrane (western blotting)
Les différentes protéines contenues dans le gel seront adsorbées sur un nouveau support (exemple: membrane de nitrocellulose). La formation de l'empreinte se dit blot en anglais d'où le nom western blot, western n'est qu'un mot en rapport avec la technique initiale du Southern blot conernant le transfert de l'ADN sur membrane de nitrocellulose ou nylon (technique inventée par Southern).
في
حالات إستثنائية، يصبح إلزامي نقل محتويات وسط العزل (بروتينات أو أحماض نووية) إلى وسط من نوع آخر للتمكن من اكتشافهم. مثلا،
من أجل اكتشاف البروتينات بالأجسام المضادة (Anticorps)، يتم نقلهم من الهلام (Gel) إلى غشاء مصنوع من النيتروسيليوز (Nitrocellulose). يتم وضع هذا الغشاء فوق الهلام، ووضع مجموعة
من طبقات أوراق الترشيح فوق ذلك. ثم يتم وضع الطبقات كلها في محلول يقوم بالتنقل إلى الأعلى عبر الأوراق، جالباً البروتينات معه إلى الغشاء. تسمى هذه الطيقة ب التلطيخ الغربي (بالإنجليزية:
Western blotting).
Immunodétection
Après transfert sur membrane des protéines à partir du gel, celles ci sont révélées par immunodétection en utilisant un anticors préalabement préparé contre elles. La réaction de détection fait appel à un anticorps secondaire marquée à la peroxydase qui tranforme un substrat de la réaction en un produit coloré visible.L'immunodétection (immunomarquage) est une des meilleures méthodes pour caractériser une protéine parmi d'autres protéines. La protéine (antigène) réagit avec les anticorps spécifiques (anticorps primaires). Une fois le complexe antigène-anticorps formé. Il est détecté grâce à un deuxième anticorps (anticorps secondaire, pouvant être marqué par une enzyme comme la peroxydase) qui détecte les emplacements où les anticorps primaires se sont fixés sur les antigènes (ptotéines) fixés à la membrane. Comme exemple, l'anticorps secondaire anti-IgG de lapin est lié (ou conjugué) de manière covalente à une peroxydase (POX) (comme l'enzyme HorseRadish Peroxidase, HRP). L'activité enzymatique est détectée grâce à une méthode de chimiluminescence pour trouver la position des complexes antigène-anticorps.
L'électrophorèse des acides nucléiques (ADN, ARN) exploite en priorité la propriété de la taille des molécules (car charge négative pour tous les acides nucléiques, due au phosphate). Néanmoins, la forme intervient aussi, lorsqu'il s'agit de plasmides.
Révélation des acides nucléiques
La révélation des acides nucléiques peut être faite par simple incubation des gels dans une solution de bromure d'éthidium ou par coloration au nitrate d'argent.
Lorsqu'on dispose d'une sonde marquée, on peut l'utiliser dans la révélation du DNA après transfert des produits séparés sur membrane de nitrocellulose (southern blotting). La détection des fragments de DNA se fait par hybrydation selon les appariement des bases A-T et C-G.
Les fragments de DNA séparés par électrophorèse sur gel peuvent provenir d'une digestion de DNA par une enzyme de restriction ou résulter une amplification de DNA par la Taq polymerase en utilisant une amorce précise 5polymérisation en chaîne du DNA ou PCR). La technique RAPD, basée sur la PCR, permet de révéler un polymorphisme de fixation d'amorces pouvant être utilisé dans le marquage des êtres vivants.
Electrophorèse de l'ADN extrait du palmier dattier (vidéo):
QUESTION 1 (électrophorèse). Pour réussir l'électrophorèse verticale d'un mélange de protéines basiques (PI entre 8 et 9) devant migrer du haut vers le bas d'un gel de pH 4,5, il faut: -cocher une réponse juste
(fixer le pôle + vers le haut et le pôle - vers le bas)(!fixer le pôle - vers le haut et le pôle + vers le bas)(!Diminuer le voltage lors de l'électrophorèse)(!Diminuer l'intensité du courant électrique pendant l'électrophorèse)(!faire une séparation à voltage constant)
QUESTION 2 (électrophorèse). Pour que l'électrophorèse des protéines sur un gel de pH précis, soit faite dans un seul sens (vertical de - vers +: du haut vers le bas du gel); il faut que: -cocher une réponse juste.
(!elles présentent des PI identiques)(!elles présentent des PI égaux au pH du gel)(elles présentent des PI inférieurs au pH du gel)(!elles présentent des PI supérieurs au pH du gel)(!elles soient séparées à voltage constant)
QUESTION 3 (électrophorèse). En électrophorèse, les protéines bien séparées sur un gel (hautements mobiles -cocher la réponse juste-
(ont un PI loin du pH du gel)(!ont un PI proche du pH du gel)
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