La détermination des séquences d'acides aminés d'une protéines (بروتينات) ou d'un peptide (بيبتيد) ou polypeptide (séquençage) est approché par des attaques enzymatiques dans des endroits précis de la molécule.
Vocabulaire:
- Acide aminé (Fr) = Amino acid (Eng) = حمض أميني (Ar).
- protéine (Fr) = Protein (Eng) = بروتين (Ar)
- Séquence (Fr) = Sequence (Eng) = متتالية(Ar)
Faire les Exercices d'abord et regarder ensuite les réponses, à la fin de cette page..
QUESTION
1 (Réponse
1). L'hydrolyse totale (HCl 6N, 110°,
24 H) d'un peptide P suivie d'une analyse d'acides aminés montre
une composition de 20 acides aminés:
Ala2, Arg, Cys2, Glu, Gly2, Leu2, Lys, Phe2, Pro, Thr, Tyr2, Val3
- La chymotrypsine donne 2 acides aminés séparés,
Phe et Tyr et 3 peptides A, B et C dont le séquençage par la méthode d'Edman donne:
A = Val-Leu-Val-Cys-Gly-Glu-Arg-Gly-Phe
B = Val-Cys-Ala-Leu-Tyr
C = Thr-Pro-Lys-Ala
- Un nouvel échantillon du peptide initial est soumis au
clivage par la trypsine. Il en résulte une Ala et 2 fragments,
D et E qui donnent après séquençage par
la méhode d'Edman:
D = Gly-Phe-Phe-Tyr-Thr-Pro-Lys
E = Val-Cys-Ala-Leu-Tyr-Val-Leu-Val-Cys-Gly-Glu-Arg
Déterminer la séquence complète du peptide P
QUESTION
2 (Réponse
2). Le peptide P0 est constitué de 6 acides aminés différents dont un acide aminé précurseur de la sérotonine et un autre sans pouvoir rotatoire. Le bromure de cyanogène coupe P0 en libérant un fragment P1 de deux acides aminés du côté
N-terminal et d'un fragment P2 de 4 acides aminés contenant un acide aminé hétérocyclique, comme révélé par le réactif d'Edman. Il a été montré que P1 et P2 sont susceptibles d'être coupés par la trypsine. Parmi les séquences suivantes, choisir celle(s) qui correspond(ent) au peptide P0:
a) LYS-MET-PRO-TRP-ARG-GLY.
b) ARG-MET-PRO-ARG-GLY-TRP.
c) HIS-MET-PRO-ARG-GLY-PHE.
d) LYS-MET-PRO-ARG-GLY-PHE.
e) ARG-MET-PRO-GLY-HIS-PHE.
QUESTION
3 (Réponse
3).
Réduit avec le béta-mercaptoethanol, un polypeptide
donne deux fragments peptidiques (chaînes):
chaîne 1: A-C-F-P-R-K-W-C-R-R-V-C et chaîne 2: C-Y-C-F-C.
Digéré avec la thermolysine, le polypeptide sous sa forme non-réduite
donne les fragments suivants:
(A,C,C,V), (R,K,F,P), (R,R,C,C,W,Y) et (C,C,F)
Indiquez la position des ponts disulfure dans ce polypeptide.
QUESTION 4 (Réponse
4).
On procède au séquençage d'un polypeptide P. On obtient les résultats suivants:
a) hydrolyse acide: (Ala4 , Val, Lys2 , Arg, Gly, Asp, Met, Pro, Trp)
b) digestion à la carboxypeptidase: Lys
c) traitement au dinitrofluorobenzène: Val
d) traitement au bromure de cyanogène: génération
de deux peptides:
peptide A: (Gly, Arg, Trp, Asp, Lys, Ala) et peptide B:
(Ala3 , Lys, Val, Met, Pro)
- Le traitement du peptide A au DNBF et carboxypeptidase donne:
DNFB: Gly Carboxypeptidase: Lys
- Le traitement du peptide B au DNFB et carboxypeptidase donne:
DNFB: Val Carboxypeptidase: Met
e) digestion à la trypsine: génère trois peptides:
peptide C: (Lys, Trp, Ala), peptide D: (Ala3 , Val,
Lys, Pro) et peptide E: (Met, Asp, Gly, Arg)
- Le traitement du peptide C au DNFB et carboxypeptidase donne: DNFB:
Trp
- Le traitement du peptide E au DNFB et carboxypeptidase donne: DNFB:
Met
- Le traitement du peptide D avec la thermolysine donne : Val, Ala,
Ala, (Ala, Lys, Pro)
Quelle est la structure primaire de ce peptide?
Réponses
Réponse
1 (Question 1)
La chymotrypsine ne coupe pas à droite de Ala: le fragment C est donc la séquence terminale. La carboxypeptidase confirme que
Ala est bien l'acide C terminal
17 | 18 | 19 | 20 | |||
Chymotrypsine | 1 | ? ? . | Thr | Pro | Lys | Ala |
Chymotrypsine | Fragment C |
L'hydrolyse
par la trypsine donne le fragment D se terminant par Lys, il s'agit de Lys19 et la comparaison des séquences
de C et D permet de mieux préciser l'extrémité
du peptide.
La reconstitution de la séquence complète est facilement réalisée en partant du peptide porteur du C terminal et
en cherchant les recouvrements des fragments.
La
séquence totale du peptide P est:
Val-Cys-Ala-Leu-Tyr-Val-Leu-Val-Cys-Gly-Glu-Arg-Gly-Phe-Phe-Tyr-Thr-Pro-Lys-Ala
Réponse
2 (Question
2)
- Le seul acide aminé sans pouvoir rotatoire : la glycine
- Le seul acide aminé précurseur de la sérotonine : le tryptophane.
- La réaction au BrCN indique qu'il y a une méthionine
(Met) en 2ème position, car il y a une coupure de la liaison
peptidique (côté COOH). Il n'est pas en dernière
position car il n'y a pas de transformation en homosérine (Hse).
Rappel:
Le bromure de cyanogène (BrCN) coupe le côté COOH
d'une méthionine (Met). Si la méthionine est en dernière
position, elle sera transformée en homosérine (Hse)
- La réaction avec le réactif d'Edman indique que le 1er
acide aminé du fragment P2 ou le 3ème du peptide P0 (côté
NH2) est un acide aminé hétérocyclique. Le seul
acide aminé hétérocyclique est la proline
(histidine et tryptophane en moidre degré).
Rappel:
Le réactif d'Edman permet de séquencer jusqu'à
50 Acides aminés. Il permet de révéler les acides
aminés du côté NH2.
- La réaction avec la trypsine nous apprend qu'il y a un acide
aminé basique (Arg ou Lys) en 1ère position du peptide
P0 et un autre qui peut être en 4ème ou en 5ème
position de P0 (car il y a une coupure du côté COOH). Attention,
il n'est pas exclu qu'il y ait un 3ème acide aminé basique
en 6ème position de P0, mais on ne dispose pas d'informations
nécessaires pour le déterminer.
Rappel:
La trypsine, endopeptidase, coupe un acide aminé basique (Lysine
ou Arginine) du côté COOH. Elle ne coupe pas
après une histidine.
Résumé: | 1 NH2 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 COOH |
Arg, Lys | Met | Pro | ? | ? | ? |
-Pour
les 3 derniers Acides aminés restant, il y a un acide aminé
basique (Arg ou Lys) en 4ème ou 5ème position de P0, une
glycine et un tryptophane.
- De plus, les 6 acides aminés de la séquence doivent
être tous différents.
- Avec ces informations, nous pouvons être sûr qu'il n'y
a pas d'acide aminé basique en dernière position
-
La séquence ARG-MET-PRO-GLY-HIS-PHE (e) est à éliminer,
car il manque un tryptophane. Aussi, la trypsine ne peut pas couper
après une histidine, bien qu'il soit un acide aminé basique.
- La séquence ARG-MET-PRO-ARG-GLY-TRP (b) est à écarter,
car il faut 6 acides aminés différents, or cette séquence
montre 2 arginines.
- La séquence LYS-MET-PRO-ARG-GLY-PHE (d) est Impossible car
il n'y a pas de tryptophane et la trypsine ne peut pas couper après
une histidine.
-
La séquence HIS-MET-PRO-ARG-GLY-PHE (c) est à éliminer.En
effet, elle ne contient pas de typtophane
- La séquence LYS-MET-PRO-TRP-ARG-GLY (a). Possible car
cette proposition respecte tous les critères énoncés.
Donc ici, seule la réponse a) est à retenir.
Réponse 3 (Question
3).
La thermolysine coupe le lien peptidique du côté N-terminal
de résidus hydrophobes. La digestion des deux fragments du peptide
suite à la réduction des ponts S-S nous donne:
chaîne 1: A-C, F-P-R-K, W-C-R-R, V-C
chaîne 2: C, Y-C F-C.
Comme les liens disulfures du peptide sont intacts lors de la digestion à
la thermolysine, certains des fragments décrits ci-dessus seront
liés via des ponts S-S impliquant des Cys. Selon les fragments
de digestion alors obtenus, on peut déduire la position des ponts
S-S comme étant:
![]() |
Remarque: Peuvent exister à la fois dans une molécules des ponts S-S- intrachaîne et interchaînes. |
Réponse 4 (Question
4)
La digestion du peptide P par la carboxypeptidase indique que l'acide aminé C-terminal est Lys.
Le traitement de P au DNFB montre que l'acide aminé N-terminal est Val.
La digestionde P par la trypsine permet d'ordonner partiellement les peptides obtenus comme suit:
peptide
C: Try-Ala-Lys peptide D: Val-(Ala, Ala, Ala, Pro)-Lys (Val est
Nterminal)
peptide E: Met-(Asp, Gly)-Arg
Le peptide E peut être ordonné grâce aux résultats
du traitement au CNBr: Met-Gly-Asp-Arg
Le traitement avec la thermolysine permet d'ordonner les Ala par
rapport à Pro : Val-Ala-Ala-Ala-Pro-Lys
Laséquence du peptide est finalement:
Val-Ala-Ala-Ala-Pro-Lys-Met-Gly-Asp-Arg-Try-Ala-Lys
LIENS UTILES
- Biochimie structurale (Contrôle final QCM corrigé, S3 (archives 2024)
- pHi et séquences (Exercices)
- Protéines. Exercices, Examens
- Protéines, peptides. Examens
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