Takween. Sciences de la vie, Biochimie
Life Sciences, Biochemistry
علوم الحياة، بيوكيمياء
Cours -- TD -- TP
Transition Secondaire-Supérieur
إنتقال ثانوي - عالي
- Invertase.
Préparation à partir le la levure boulangère
- Aller aux tests de
l'effet de la concentration du substrat (notion de Km et Vmax) et effets
des inhibiteurs
- Faire un QCM sur l'invertase
- Faire un Contrôle
temporisé et noté en enzymologie
Cette
partie du travail pratique est précédée par les parties:
- Introduction sur l'invertase dont
les sources et les substrats catalysés.
- Extraction de l'invertase
et le test de sa cinétique par dosage des sucres réducteurs
libérés suite à l'hydrolyse du saccharose.
L'influence
de la concentration du sbstrat (saccharose) et l'effet du sulfate de cuivre
sont étudiés sur la même série d'expérience.
En plus d'un tube témoin (tube 0), on teste l'influence de 4 concentrations
de saccharose correspondant à 4 volumes différents (0,2 ml,
0,3 ml, 0,4 ml et 0,6 ml) d'une solution mère de saccharose 100 mM.
Le tube témoin contient 1 ml d'eau à la place du saccharose
(tube 0).
Le test est répété deux fois, avec les mêmes concentrations
de substrat, mais en ajoutant séparément 0,2 ml et 0,4 ml d'une
solution de sulfate de cuivre de concentration égale à 15 mM.
Pour réaliser cette expérience on utilise 13 tubes numérotés
de 0 à 12. Ils sont préparés selon les 3 tableaux suivants:
- Calculer les concentrations finales du saccharose dans chaque tube (3 ml de mélange réactionnel).
- Calculer les concentrations finales du sulfate cuivre dans chaque tube (3 ml de mélange réactionnel).
- A l'aide de la gamme étalon du dosage des sucres réducteurs, déterminer les quantités (µmoles) de ces sucres résultant de l'action de l'invertase sur le saccharose en absence de CuSO4 (tube 1 au tube 4) et en présence des deux concentrations de sulfate de cuivre (tube 5 au tube 12). En déduire la quantité de saccharose hydrolysé en µmoles pour chaque tube.
- Sachant que la réaction d'hydrolyse du saccharose a duré 5 minutes, déterminer la vitesse initiale (vi) en µmoles de saccharose hydrolysé par minute pour chaque concentration finale de saccharose, en absence et en présence de CuSO4.
-
Organiser les vitesses obtenues dans un tableau à entrée double.
Placer horizontalement, les concentrations finales en saccharose des 12 tubes
(numérotés 1 à 12). Verticalement, placer les concentrations
finales en CuSO4, y compris la concentration 0 mM. Le tableau final
sera à 36 cases devant être remplies par les vitesses initiales
correspondantes. Dans un tableau similaire, on peux organiser les données
en faisant mention des inverses des concentrations (1/(S)) et les inverses
des vitesses initiales (1/vi).
- Sur le même graphique, tracer les trois lcourbes 1/vi = f(1/(S)) ou
ou représentation de Linweaver-Burk (voir les
autres représentations possibles), montrant les activité
de l'invertase en absence de sulfate de cuivre ((CuSO4) = 0 mM)
et en présence de cet inhibiteur (avec deux concentrations). En déduire
les valeurs de Vmax et Km de l'invertase
de la levure de boulangerie en absence et en présence du sulfate de
cuivre. Comparer l'affinité de l'invertase vis-à-vis du saccharose
en absence et en présence de CuSO4.
- Quel type d'inhibition exerce le sulfate de cuivre vis-à-vis du saccharose pour affecter l'activité de l'invertase de levure de boulangerie ? Justifier vos réponses.
The presence of heavy metal ions such as Cu2+ may inhibit the activity of invertase. This is due to the high affinity of the sulfhydryl group on cysteine and methionine residues in a protein for the Cu2+ ion.
Remarque:
d'après Asare-Brown & Bullock, 1988, Biochemical education 16 (2),
p. 98: 'At 40°C, a marked depression of invertase activity at sucrose
concentrations above 0.3 M is apparent (Fig). At the higher sucrose concentrations,
the reaction medium becomes highly viscous and regular agitation to ensure
mixing is vital to obtain consistent results. The inhibition is temperature
dependent, and an investigation to find the optimum temperature/substrate
concentration combination is an interesting class exercise'.
Substrate inhibition of invertase has been attributed to both increased
viscosity and changes in the activity of water associated with concentrated
sucrose solutions (Invertase = hydrolase). However, Combes and Manson demonstrated
that artificially increasing the viscosity of dilute sucrose solutions, using
reagents such as carboxymethyl- cellulose, had no significant effect on invertase
activity. Conversely, the use of reagents known to have a high affinity for
water such as poly(1,2-ethanediol), resulted in a marked depression of activity,
suggesting that water activity is in fact the key factor'
----> LIENS UTILES:
- 3D
Structure (JMOL) of Thermotoga maritima invertase
Revenir aux parties:
- Introduction sur l'invertase dont
les sources et les substrats catalysés.
- إستخلاص أنزيم
الأنفرتاز من خميرة المخبز
Extraction de l'invertase à partir de la levure boulangère et
test de l'activité enzymatique (TP)
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