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ELECTROPHORESE DES ISOENZYMES ET DETECTION PRECOCE DES HYBRIDES SOMATIQUES. CONTROLE DES TP


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ELECTROPHORESE DES ISOENZYMES. EVALUATION (EXAMEN)


Un chercheur en Biotechnologie et amélioration des plantes projette de créer un hybride interspécifique alliant 2 traits agronomiques importants provenant de 2 espèces végétales (P-1 et P-2). Il a opté pour le suivi des obtentions de la fusion de protoplastes par une électrophorèse verticale des isoenzymes de 2 enzymes (E1 et E2) de pI approximatifs respectifs 6,5 et 8,0.
Protoplaste.Fusion


Des gels de polyacrylamide ont servi pour supports de migration. Ils sont préparés selon le tableau suivant.

Gels de concentration (10 ml) Gels de séparation (15 ml)
Acrylamide-bis acrylamide 30:0,8% (ml) 1,87 6,25
Tris-HCl 3,0 M (pH 8,8) (ml) 0 1,87
Tris-HCl 0,5 M (pH 6,8) (ml) 2,50 0
Eau distillée (ml) 5,00 6,25
Persulfate d'ammonium 1,5% (ml) 0,60 0,60
TEMED (ml) 0,03 0,03

Après révélation des deux enzymes, les zymogrammes obtenus sont représentés par les 2 figures suivantes.
Electrophorèse. Isoenzymes
Fig.1
Electrophorèse. Isoenzymes
Fig.2


Questions


-1) Rappeler le(s) propriété(s) moléculaire(s) exploitée(s) dans la séparation des isoenzymes par électrophorèse.
- 2) Calculer les concentrations des gels de polyacrylamide en acrylamide, Tris-HCl (pH 8,8) et persulfate d'ammonium.
- 3) Quelle est l'enzyme susceptible d'être bien résolue sur le gel de polyacrylamide utilisé dans cette étude ? Justifier votre réponse. A quelle figure correspond son zymogramme ?
- 4) Quelle(s) est(sont) les amélioration(s) technique(s) que vous pouvez proposer pour la séparation de l'enzyme dont la résolution reste incomplète ?
- 5) Quelles peuvent être les raisons justifiant le choix par le chercheur des isoenzymes parmi les autres marqueurs de type RFLP et RAPD et AFLP.
- 6) Interpréter brièvement les zymogrammes des deux enzymes (loci, structure de l'enzyme, nombre d'allèles et génotypes).
- 7) A l'aide des figures 1 et 2, indiquer le(s) plant(s) qui montre(nt) le ou les hybrides somatiques.


Réponses


- Réponse à la question 1). Le(s) propriété(s) moléculaire(s) exploitée(s) dans la séparation des isoenzymes par électrophorè sont le poids moléculaire (taille) et l'ionicité (charge électrique)
- Réponse à la question 2). Les concentrations des gels de polyacrylamide en acrylamide, Tris-HCl (pH 8,8) et persulfate d'ammonium.
Concentrations finales en acrylamide:
-- Gel de concentration: dilution = 10/1,87 = 5,35 fois et concentration finale = 30/5,35 = 5,6%
-- Gel de séparation: dilution = 15/6,25 = 2,4 fois et concentration finale = 30/2,4 = 12,5%
Concentration de Tris-HCL (pH 8,8):
-- Gel de concentration: 0 M
-- Gel de séparation: dilution = 15/1,87 = 8,02 fois et concentration finale = 3/8,02 = 0,37 M
- Concentrations de persulfate d'ammonium:
-- Gel de concentration: dilution 10/0,60 = 16,67 fois. Concentration finale = 1,5%/16,67 = 0,09%
-- Gel de séparation: dilution 15/0,60 = 25 fois. Concentration finale = 1,5%/25 = 0,06%
--> Rappel sur le calcul des concentrations
- Réponse à la question 3). L'enzyme susceptible d'être bien résolue sur le gel de polyacrylamide utilisé dans cette étude est l'enzyme E1 de pI 6,5. En effet, elle aura une charge électrique hautement négative dans un gel à pH 8,8 et migre rapidement vers l'anode (+). Ceci est en rapport avec la relation :Mobilité = k . (pH - pI) / masse molaire, où pI est le point isoélectrique de la molécule (The larger the difference between the pI and the pH of interest, the greater the net charge on the protein). Le zymogramme de cette enzyme est représenté par la figure 1 montrant des isoformes avec un Rf de 0,63.
- Réponse à la question 4). Les améliorations techniques qui tendent à mieux séparer l'enzyme E2 (incomplètement séparée, Rf faible) sont:
-- Action sur l'ionicité en chargeant l'enzyme encore plus négativement par utilisation de gels à pH encore plus basique par rapport au pI 8,0. C'est à dire l'éloigner plus de son pI (exemple des gels à pH 9 ou plus au lieu de pH 8,8) ou des gels à pH acides en changeant les polarités des bornes car la protéine sera chargée positivement dans cette dernière condition et doit se déplacer vers le bas dans un système d'électrophorèse verticale.
-- Action sur la taille par diminution de la concentration du gel en polyacrylamide. La mobilité électrophorétique est inversement proportionnelle à la force de rétention et viscosité.
- Réponse à 5). Les raisons justifiant le choix par le chercheur des isoenzymes parmi les autres marqueurs de type RFLP et RAPD et AFLP sont:
-- RFLP: même si elle donne un marquage codominant, la technique RFLP reste 'lourde' exigeant plus de temps avec une étape de transfert sur membrane
-- RAPD et AFLP: donnent un marquage dominant, à l'inverse des isoenzymes (codominant). Avec RAPD et AFLP; l'identification d'hybrides est très difficile
- Réponse à la question 6):
-- Zymogramme de l'enzyme E1 (Fig.1): Un locus codant pour une enzyme monomérique (nombre max de bandes = 2 = n + 1 doc n = 1) avec 2 allèles A et B donnant les génotypes homozygotes AA (individus 2 et P-2) et BB (individus P-1, 3 et 4) ainsi que des hétérozygotes (individu 1)
-- Zymogramme de l'enzyme E2 (Fig.2): Un locus codant pour une enzyme tétramérique (nombre max de bandes = 5 = n + 1 doc n = 4) avec 2 allèles A et B donnant les génotypes homozygotes AA (individus 3, 4 et P-2) et BB (individus P-1 et 2) ainsi que des hétérozygotes (individu 1)
- Réponse à la question 7): Les plants correspondant aux hybrides somatiques interspécifiques sont représentés par les plants numéro 1.


Video 'genetic diversity through molecular markers' (master level, Cadi Ayyad University, 2019:



LIENS UTILES


Marqueurs isoenzymatiques
- TP Isoenzymes des folioles du palmier dattier
- Détection d'hybrides interspécifique du genre Cuphea
- Electrophorèse des isoenzymes. Examen 2007
- Electrophorèse. Aspect théorique
- QCM Electrophorèse
- QCM Electrophorèse, supports de migration


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