ADP-Glucose pyrophosphorylase et pectine méthylestérase. Mécanisme de catalyse et effet des inhibiteurs (Examen)


L'ADP-Glucose pyrophosphorylase (AGPase) est une enzyme impliquée dans la synthèse de l'amidon. La pectine méthylestérase (PME) est une enzyme catalysant l'hydrolyse de la pectine des paroi des plantes


Examen de l'Elément de Module: 'Relation sructure-fonction dans le métabolisme primaire et éléments de base du métabolisme secondaire des plantes, Module 'Biochimie, Génétique et Amélioration des Plantes', Parcours S5 : 'Biologie Appliquée aux Productions Végétales', Novembre 2013 (durée: 1h 15') ..... Corrections brèves


QUESTION 1


L'ADP-Glucose pyrophosphorylase (AGPase) est une enzyme impliquée dans la synthèse de l'amidon chez les plantes suivant la réaction ci-contre.

Pyrophosphorylase, AGPase

Pour étudier le mécanisme cinétique de cette enzyme extraite de la pomme de terre, Boehlein et al., 2013, (Arch.Biochem. Biophys. 535, 214-226 ont étudié la cinétique enzymatique en présence des substrats Glucose-1-phosphate (Glc1P) et ATP. Les cinétiques 1/v = f(1/(S)) (représentations de Lineweaver-Burk) sont résumées dans la figure 1 (A et B) ci-dessous. En testant l'effet du produit ADP-Glc sur la fixation de l'ATP, les résultats ont montré que le produit forme uniquement un complexe binaire en présence de l'enzyme et de l'ATP. Par contre, le même produit ne s'est pas montré compétitif vis-à-vis du substrat Glc1P. Le mécanisme de catalyse de l'AGPase révélé dans cette étude est susceptible de confirmer les résultats d'expériences de dialyse à l'équilibre réalisées en présence de l'enzyme et les deux substrats séparément, selon lesquels l'état final de l'équilibre ne montre pas de différence de concentration en Glc1P entre les chambres 'avec enzyme' et 'sans enzyme' (contrairement aux expériences réalisées avec l'ATP.

AGPase cinétique

1. En se basant uniquement sur la cinétique, proposer un ou plusieurs mécanisme(s) de catalyse susceptible(s) de rendre compte de toutes les cinétiques de l'AGPase obtenues avec les substrats Glc1P et ATP.
2. Quelle est le type d'inhibition exercée par l'ADP-Glc vis-à-vis de l'ATP.
3. Interpreter les résultats attendus des expériences de la dialyse à l'équilibre.
4. Déterminer le mécanisme de catalyse exact de l'AGPase de la pomme de terre. Justifiez vos réponses.
5. Donner le schéma de Cleland général correspondant au mécanisme de catalyse de 'AGPase de pomme de terre.


QUESTION 2.


La pectine méthylestérase (PME), appelée aussi pectine démethoxylase ou pectase, est une enzyme qui catalyse l'hydrolyse de la liaison C-O du groupe ester méthylique de la pectine des paroi des plantes (voir réaction). Il en résulte la libération du méthanol et la précipitation du pectate.

Pectine méthylestérase (PME). Enzyme

Cette réaction peut être bloquée par certains antioxydants dans le but de minimiser (voire même bloquer) la concentration du méthanol libéré pour améliorer la qualité de certaines denrées alimentaires dont les jus de fruits. Chen C-H et al. 2009, J. Instit. Brewing) ont testé l'effet l'acide coumarique sur la PME de la vigne. L'étude de la cinétique enzymatique de la transformation de la pectine en présence de l'acide coumarque permet d'aboutir à une représentation de Lineweaver-Burk résumée dans la figure suivante.

PME. Inhibition

1. Quel type d'inhibition exerce l'acide coumarique vis-à-vis de la pectine. Quelles sont les formes de la PME sur lesquelles se fixe l'acide coumarique. Justifier votre réponse.
2. Dans quel type de mécanisme de catalyse des réactions enzymatiques à deux substrats ce mode d'inhibition est le plus fréquent.


Corrections brèves


Question 1
1. Interprétation des cinétiques de l'AGPase
- Avec (ATP) variable et (Glc1P) constante: Le diagramme primaire 1v = f(1/(ATP) de la cinétique de l'ADP-glucose pyrophosphorylase (AGPase) est sous formes d'un faisceau de droites faisant intersection à gauche de l'axe des ordonnée (Fig 1A)..
- Avec (Glc1P) variable et (ATP) constante, la cinétique 1v = f(1/(Glc1P) de l'ADP-glucose pyrophosphorylase est sous forme d'un faisceau de droites faisant intersection à gauche de l'axe des ordonnée (Fig 1B).
Ces cinétiques sont en faveur des mécanismes de catalyse: 1/ Mécanisme au hasard fixation dépendante et 2/ Mécanisme Séquencé.
2.Le fait que le produit ADP-Glc forme uniquement un complexe binaire en présence de l'enzyme et de l'ATP est en faveur d'une inhibition compétitive de l'ADP-Glc vis à vis de l'ATP.
3. Les résultats attendus des expériences de la dialyse à l'équilibre montrent que le Glc1P ne se fixe plus sur l'enzyme (ADP-Glucose pyrophosphorylase) libre. Par contre, l'ATP forme un complexe avec l'ADP-Glucose pyrophosphorylase.
4. mécanisme de catalyse exact de l'ADP-Glucose pyrophosphorylase (AGPase) de la pomme de terre:
Les expériences de la dialyse à l'équilibre montrent que le Glc1P ne se fixe plus sur l'ADP-Glucose pyrophosphorylase. Par contre, l'ATP forme un complexe avec l'enzyme. Ces résultats confirment la mise en jeu d'un mécanisme ordonné (séquencé) où l'ATP est le substrat directeur (premier substrat). Les mécanismes aléatoires (au hasard) ne peuvent être adoptés, car dans ces derniers, tous les substrats et les produits peuvent se fixer sur l'enzyme libre..En se basant sur les diagrammes primaires de la cinétique de l'ADP-Glucose pyrophosphorylase et les expériences de la dialyse à l'équilibre, le mécanisme de catalyse de l'AGPase est un mécanisme séquencé.
5. Schéma de Cleland général correspondant au mécanisme de catalyse de 'AGPase de pomme de terre:
Du moment où le produit ADP-Glc est inhibiteur compétitif vis à vis de l'ATP (fixation sur la même forme d'enzyme, E), l'ADP-Glc est le dernier produit à être libéré. Le schéma de Cleland doit montrer l'ATP (premier substrat), le Glc1P (deuxième substrat), PPi (premier produit) et ADP-Glc (dernier produit)
Les auteurs de cet article scientifique ont confirmé un mécanisme de type séquencé theorell-Chance dont le schéma de Cleland est:

Mécanisheorell-Chanceme T

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Question 2:
1. La représentation de Lineweaver-Burk de la cinétique de la pectine méthylestérase (PME) de la vigne en présence et en absence de l'acide coumarique est sous forme d'un faisceau de droites faisant intersection à gauche de l'axe des ordonnées et en bas de l'axe des abscisses. Ceci montre l'acide coumarique exerce une inhibition mixte vis-à-vis de la pectine. L'acide coumarique se fixe sur la forme libre de l'enzyme (E) et la forme complexée de l'enzyme avec la pectine (forme ES) avec des affinités différentes.
2. L'inhibition mixte, comme mode d'inhibition par les analogues de substrats dans les réactions enzymatiques à deux substrats, est caractéristique des mécanismes au hasard fixation dépendante.


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