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Techniques d'analyse des protéines. Exercices

Après leur extraction, les protéines sont analysées par des techniques de séparation variées dont l'électrophorèse et la chromatographie.

QUESTIONS

Q1. Parmi les propsitions suivantes, lesquelles sont fausses ? a: le pI est la valeur de pH pour laquelle une prot�ine n'a pas de charge. b: � une valeur de pH �gale � son pI, une prot�ine ne migre pas dans un champs �lectrique au cours d'une électrophorèse.c: une prot�ine acide aura un pI plus grand que 7,0. d: une prot�ine basique aura un pI plus grand que 7,0.

Q2. Les 5 prot�ines dont les masses mol�culaires et les points iso�lectriques sont donn�s ci-dessous, sont s�par�es par électrophorèse sur gel de polyacrylamide une des techniques de séparation très utilisée) en pr�sence de SDS. Donner l'ordre de leur migration du sommet (le point de d�p�t des �chantillons) � la partie inf�rieure du gel. a: alpha-Antitrypsine (PM: 45000, pI: 5,4), b: Cytochrom c (PM: 13400, pI: 10,6), c: Myoglobine (PM: 17000, pI: 7,0), d: Albumine s�rique (PM: 69000, pI: 4,8), e: Transferrine (PM: 90000, pI: 5,9).

Q3. Si les 5 prot�ines de Q2 sont s�par�es par iso�lectrofocalisation, quelle pourrait être leur distribution entre les extr�mit�s positives (anode,+) et n�gatives (cathode, -) du gel ? Donner les valeurs les plus hautes et les plus faibles de pH

Q4. La s�paration des peptides P (Lys-Gly-Ala-Gly), Q (Lys-Gly-Ala-Glu) et R (His-Gly-Ala-Glu) a �t� effectu�e par électrophorèse sur papier r�alis�e � diff�rents pH. Quelle serait la direction de migration (A: vers l'anode, C: vers cahode et O: immobile) pour ces peptides aux valeurs de pH donn�es: a: pH=2,0, b: pH=4,0, c: pH=6,0, d: pH=11,0.

Q5. Associer les crit�re de s�paration TAILLE (T), CHARGE (C), LIAISON SPECIFIQUE (L) et SOLUBILITE (S) � une ou plusieurs m�thodes de s�parations suivantes: a: électrophorèse, b: Chromatographie d'exclusion (ge-filtration), c:
Relargage par sels (salting out), d: Immunoprecipitation, e: Iso�lectrofocalisation, f: Chromatographie d'affinit�, g: Chromatographie d'�change d'ions, h: Ultracentrifugation de zone.

Q6. Parmi les techniques de séparation et d'analyse suivantes pr�ciser celles qui sont utilis�es pour localiser les ponts dissulfure dans une prot�ine: a: R�duction pr�alable suivie de carboxym�thylation de la prot�ine, b: clivage de la prot�ine par hydrolyse acide, c:
Clivage sp�cifique maintenant les ponts dissulfure intacts, d: s�paration par électrophorèse sur gel de polyacrylamide-SDS des diff�rents peptides, e: S�paration des peptides par électrophorèse bidimensionnelle, un traitement par acide performique s'intercaant entre la 1ere. et la 2eme. dimension.

Q7. Un mélange d'acides aminés est séparé par chromatographie de partage à pH 6,0. Les intérprétations suivantes sont-elles vraies ou fausses (V/F) ? 1/ Val migre plus loin que Ser. 2/ Gln migre plus loin que Asn. 3/ Phe migre plus loin que Val. 4/ Lys migre plus loin que Ileu. 5/ Asp migre plus loin que Ala.

Protéines. Techniques de séparation

REPONSES

Q1. a, c. Quel que soit le pH, une prot�ine n'est jamais d�pourvue de charge �lectrique; � son pI la somme de toutes les charges est �gale � z�ro.

Q2. Sommet: e, d, a, c, b partie inf�rieure.

Q3. pH �lev� (-) b, c, e, a, d pH faible (+).

Q4. a: P (C), Q (C), R (C); b: P (C), Q (C), R (C); c: P (C), Q (O), R (A); d: P (A), Q (A), R (A). Par exemple, le peptide Q porte une charge nette de +1,5 � pH 2,0 (cha�ne lat�rale Lys: +1; groupement alpha-amin�: +1, cha�ne lat�rale Glu: 0; et groupement carboxyle terminal: -0,5, puisque le pH co�ncide avec sa valeur de pK). A pH 4,0, la charge nette est +0,5; la cha�ne lat�rale de Glu est � demi-ionis�e (-0,5), mais le carboxyle terminal est presque complètement ionis� (-1). A pH 6,0, la charge nette est 0 due � une charge +2 apport�e par le r�sidu Lys e une charge -2 apport�e par le r�sidu Glu. A pH 11,0, le groupement alpha-amin� est d�proton� (charge 0) et la cha�ne lat�rale Lys est � demi-proton�e (charge +0,5); la charge nette est donc de -1,5.

(COO-)

pH 2,0: +H3N-Lys-Gly-Ala-Glu-COOH +1,5, pH 6,0: +H3N-Lys-Gly-Ala-Glu-COO- 0

NH3+ COOH NH3+ COO-

Q5. a: T, C, b: T, c: S, C d: L, e: C, f: L, g: C, h: T.

Q6. c, e. L'acide performique oxyde les liaisons disulfure en groupement SO(3-) et lib�re de nouveaux peptides.

Q7. 1/ (Vrai) La Val possède une chaîne carbonnée non polaire. La Ser est un acide aminé polaire (hydroxyle sur C bete). 2/ (Vrai) Gln et Asn ne sont pas chargés à pH 6,0. Ce sont des acides aminés polaires. Néanmoins, la Gln possède un squelette carbonné plus long que celui de Asn et sera entraîné un peu plus loins. 3/ (Vrai) Phe est un acide aminé aromatique à caractère hydrophobe marqué. Val est un acide aminé non polaire mais moins hydrophobe que Phe. 4/ (Faux) Lys sera chargée positivement à pH 6,0. Elle sera retenue par la phase stationnaire. Quant à Ileu (acide aminé non polaire), elle sera entraîné par la phase mobile. 5/ (Faux) Asp est un acide aminé chargé négativement à pH 6,0. Ala est un acide aminé non polaire. Glu sera retenu par la phase stationnaire (polaire) alors que Ala sera ezntraîné par la phase organique

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Techniques d'analyse des protéines. Exercices
Après leur extraction, les protéines sont analysées par des techniques de séparation variées dont l'électrophorèse et la chromatographie.
QUESTIONS Q1. Parmi les propsitions suivantes, lesquelles sont fausses ? a: le pI est la valeur de pH pour laquelle une prot�ine n'a pas de charge. b: � une valeur de pH �gale � son pI, une prot�ine ne migre pas dans un champs �lectrique au cours d'une électrophorèse.c: une prot�ine acide aura un pI plus grand que 7,0. d: une prot�ine basique aura un pI plus grand que 7,0. Q2. Les 5 prot�ines dont les masses mol�culaires et les points iso�lectriques sont donn�s ci-dessous, sont s�par�es par électrophorèse sur gel de polyacrylamide une des techniques de séparation très utilisée) en pr�sence de SDS. Donner l'ordre de leur migration du sommet (le point de d�p�t des �chantillons) � la partie inf�rieure du gel. a: alpha-Antitrypsine (PM: 45000, pI: 5,4), b: Cytochrom c (PM: 13400, pI: 10,6), c: Myoglobine (PM: 17000, pI: 7,0), d: Albumine s�rique (PM: 69000, pI: 4,8), e: Transferrine (PM: 90000, pI: 5,9). Q3. Si les 5 prot�ines de Q2 sont s�par�es par iso�lectrofocalisation, quelle pourrait être leur distribution entre les extr�mit�s positives (anode,+) et n�gatives (cathode, -) du gel ? Donner les valeurs les plus hautes et les plus faibles de pH Q4. La s�paration des peptides P (Lys-Gly-Ala-Gly), Q (Lys-Gly-Ala-Glu) et R (His-Gly-Ala-Glu) a �t� effectu�e par électrophorèse sur papier r�alis�e � diff�rents pH. Quelle serait la direction de migration (A: vers l'anode, C: vers cahode et O: immobile) pour ces peptides aux valeurs de pH donn�es: a: pH=2,0, b: pH=4,0, c: pH=6,0, d: pH=11,0. Q5. Associer les crit�re de s�paration TAILLE (T), CHARGE (C), LIAISON SPECIFIQUE (L) et SOLUBILITE (S) � une ou plusieurs m�thodes de s�parations suivantes: a: électrophorèse, b: Chromatographie d'exclusion (ge-filtration), c: Relargage par sels (salting out), d: Immunoprecipitation, e: Iso�lectrofocalisation, f: Chromatographie d'affinit�, g: Chromatographie d'�change d'ions, h: Ultracentrifugation de zone. Q6. Parmi les techniques de séparation et d'analyse suivantes pr�ciser celles qui sont utilis�es pour localiser les ponts dissulfure dans une prot�ine: a: R�duction pr�alable suivie de carboxym�thylation de la prot�ine, b: clivage de la prot�ine par hydrolyse acide, c: Clivage sp�cifique maintenant les ponts dissulfure intacts, d: s�paration par électrophorèse sur gel de polyacrylamide-SDS des diff�rents peptides, e: S�paration des peptides par électrophorèse bidimensionnelle, un traitement par acide performique s'intercaant entre la 1ere. et la 2eme. dimension. Q7. Un mélange d'acides aminés est séparé par chromatographie de partage à pH 6,0. Les intérprétations suivantes sont-elles vraies ou fausses (V/F) ? 1/ Val migre plus loin que Ser. 2/ Gln migre plus loin que Asn. 3/ Phe migre plus loin que Val. 4/ Lys migre plus loin que Ileu. 5/ Asp migre plus loin que Ala. REPONSES Q1. a, c. Quel que soit le pH, une prot�ine n'est jamais d�pourvue de charge �lectrique; � son pI la somme de toutes les charges est �gale � z�ro. Q2. Sommet: e, d, a, c, b partie inf�rieure. Q3. pH �lev� (-) b, c, e, a, d pH faible (+). Q4. a: P (C), Q (C), R (C); b: P (C), Q (C), R (C); c: P (C), Q (O), R (A); d: P (A), Q (A), R (A). Par exemple, le peptide Q porte une charge nette de +1,5 � pH 2,0 (cha�ne lat�rale Lys: +1; groupement alpha-amin�: +1, cha�ne lat�rale Glu: 0; et groupement carboxyle terminal: -0,5, puisque le pH co�ncide avec sa valeur de pK). A pH 4,0, la charge nette est +0,5; la cha�ne lat�rale de Glu est � demi-ionis�e (-0,5), mais le carboxyle terminal est presque complètement ionis� (-1). A pH 6,0, la charge nette est 0 due � une charge +2 apport�e par le r�sidu Lys e une charge -2 apport�e par le r�sidu Glu. A pH 11,0, le groupement alpha-amin� est d�proton� (charge 0) et la cha�ne lat�rale Lys est � demi-proton�e (charge +0,5); la charge nette est donc de -1,5. (COO-) pH 2,0: +H3N-Lys-Gly-Ala-Glu-COOH +1,5, pH 6,0: +H3N-Lys-Gly-Ala-Glu-COO- 0 NH3+ COOH NH3+ COO- Q5. a: T, C, b: T, c: S, C d: L, e: C, f: L, g: C, h: T. Q6. c, e. L'acide performique oxyde les liaisons disulfure en groupement SO(3-) et lib�re de nouveaux peptides. Q7. 1/ (Vrai) La Val possède une chaîne carbonnée non polaire. La Ser est un acide aminé polaire (hydroxyle sur C bete). 2/ (Vrai) Gln et Asn ne sont pas chargés à pH 6,0. Ce sont des acides aminés polaires. Néanmoins, la Gln possède un squelette carbonné plus long que celui de Asn et sera entraîné un peu plus loins. 3/ (Vrai) Phe est un acide aminé aromatique à caractère hydrophobe marqué. Val est un acide aminé non polaire mais moins hydrophobe que Phe. 4/ (Faux) Lys sera chargée positivement à pH 6,0. Elle sera retenue par la phase stationnaire. Quant à Ileu (acide aminé non polaire), elle sera entraîné par la phase mobile. 5/ (Faux) Asp est un acide aminé chargé négativement à pH 6,0. Ala est un acide aminé non polaire. Glu sera retenu par la phase stationnaire (polaire) alors que Ala sera ezntraîné par la phase organique	- Protéines et protéomique. Cours - TD techniques de séparation des protéines - TP - EXAMEN eeeeeeeee-book Lecture Eclair
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