Phylogénie moléculaire basée sur le génome nucléaire, le plastome et le mitochondriome


Liens utiles:
1. TECHNIQUE D'ELECTROPHORESE
- 2. MARQUEURS BIOCHIMIQUES ET MOLECULAIRES


La phylogénie moléculaire est basée sur l’analyse comparative des séquences d'ADN ou de protéines. Elle compléte les méthodes traditionnelles de classification basées sur l'observation des caractères morphologiques et anatomiques.
La phylogénie moléculaire utilise les gènes des organismes vivants pour élaborer des arbres phylogénétiques en comparant les caractères moléculaires (séquences nucléotidiques ou protéiques).
La phylogénie moléculaire essaie de retracer l'accumulation des mutations dans les génomes au cours de l'évolution des espèces. Elle permet de reconstruire l'histoire évolutive des organismes. Les espèces ont des génomes d'autant plus proches qu'elles ont divergé récemment depuis leur ancêtre commun.

Important: Pour comprendre ce cours, il faut réviser la partie des techniques ELECTROPHORESE et MARQUEURS BIOCHIMIQUES ET MOLECULAIRES


Génome nucléaire, Plastome, Mitochondriome, Transcriptome


NOYAU : Génome nucléaire = Génome
PLASTES : Génome plastidial = Plastome
MITOCHONDRIES: Génome mitochondrial = Mitochondriome
Transcriptome: ensemble des ARN (messagers, ribosomiques, de transfert et autres espèces d'ARN) issus de la transcription du génome.


Les régions du génome utilisées pour la phylogénie moléculaire sont appelées marqueurs moléculaires. Elles doivent remplir les conditions suivantes:
1/ elles doivent être ubiquistes, c'est-à- dire présentes chez tous les taxons étudiés
2/ elles doivent contenir une région variable spécifique de chaque espèce et encadrée par deux séquences conservées.

ADN. Séquences variables

La comparaison des séquences des régions variables des différentes espèces permet d’apprécier leur proximité ou leur éloignement phylogénétique.
La phylogénie moléculaire est de plus en plus utilisée pour l'identification et la classification des êtres vivants.


Génome nucléaire


En plus des gènes codant pour des protéines, Les gènes donnant des ARNs sont très importants pour la phylogénie moléculaire.
ARN ribosomique: L'ARN ribosomique est lui-même produit à partir de gènes codés dans l'ADN. Il représente 80 % de l'ARN total d'une cellule (ARN ribosomique, ARN messager, ARN de transfert). Les ARN ribosomiques sont transcrits sous forme de précurseurs plus longs qui sont clivés ensuite pour donner les différents ARNr. Chez les eucaryotes, ce processus de maturation/clivage se déroule dans le nucléole. Associé à des protéines, les ARNr forment les ribosomes (dans le cytoplasme) qui permettent la lecture de l'information génétique transcrite par l'ARN messager. Au niveau des ribosomes, les ARNr sont repliés sur eux-mêmes, formant une structure tridimensionnelle compacte qui leu confère plus de protection. Ils deviennent ainsi très stables par comparaison au ARN messagers.
L'ARN de la petite sous-unité du ribosome est une molécule dont la séquence est très utilisée pour faire des études de phylogénie moléculaire. On la trouve conservée dans l'ensemble des organismes vivants. En comparant les séquences du gène de cet ARN (au niveau de l'ADN) chez différentes espèces, il devient possible d'évaluer leur parenté évolutive. La base de données du 'Ribosomal database project' (rdp.cme.msu.edu) recense les séquences de l'ARN ribosomique 16S (chez les Procaryotes) ou 18S (chez les Eucaryotes) de plus de 270 000 espèces vivantes. Ces données permettent de reconstituer un arbre phylogénétique des espèces.

L’ARNr 16S (constituant la petite sous-unité des ribosomes des procaryotes) s’est imposé comme marqueur de référence chez les procaryotes. Les gènes codant cet ARN (ARNr 16S) sont appelés ADNr 16S (16S rDNA en anglais) et leur séquence est très utilisée en phylogénie.


Plastome


Le plastome est souvent utilisé dans le séquençage et la phylogénie moléculaire des plantes, car:
- Il a une taille réduite
- Il existe sous forme de milliers de copies par cellule.
- Il est hautement conservé
La transmission du génome plastidial d'une génération à la suivante est non mendélienne (transmission cytoplasmique). Elle est essentiellement maternelle.
Une cellule végétale possède en moyenne une centaine de chloroplastes et un chloroplaste possède une centaine de copie d'ADNcp (molécule circulaire). Ainsi, une cellule possède environ 10 000 copies d'un gène chloroplastique. La taille moyenne de l'ADNcp est comprise entre 120 et 160 kpb.


Mitochondriome


L'ADN mitochondrial (ADNmt). La transmission de l'ADNmt est généralement non mendélienne. Dans la plupart des cas, il est transmis par la mère. Cependant il existe de nombreuses exceptions chez les plantes, les champignons et même chez les animaux.
Les gènes mitochondriaux, et en particulier le gène codant pour la sous-unité I de la cytochrome c oxydase (CoxI), sont utilisés chez les eucaryotes.
De même, le gène du cytochrome b porté par le mitochondriome a été utilisé pour comparer plusieurs espèces.

ADN des mitochondries
Gène du cytochrome b

Transcriptome


Le transcriptome est l'ensemble des ARN (messagers, ribosomiques, de transfert et autres espèces d'ARN) issus de la transcription du génome. L'analyse transcriptomique peut caractériser le transcriptome d'un tissu particulier, d'un type cellulaire, ou comparer les transcriptomes entre différentes conditions expérimentales.

Par opposition au ARNr, les ARN messagers de structure fragile, ont une durée de vie courte.


Phylogénie moléculaire par séquençage de gènes


Séquençage de l'ADN selon la méthode de Sanger


Le séquençage d'un ADN est la détermination de la succession des nucléotides le composant.. Cette technique exploite les connaissances acquises depuis une trentaine d'années sur les mécanismes de la réplication de l'ADN. Une amorce marquée à la radioactivité P32 est utilisée dans la polymérisation.
Les réactions de polymérisation pour synthétiser un ADN complémentaire à l'ADN à séquencer se font par addition de désoxyribonucléotides (dNTP) et des nucléotides légèrement différents : les didésoxyribonucléotides (ddNTP). Les ddNTP diffèrent des dNTP par l'absence d'un groupement OH bien précis. En effet, lorsqu'une ADN polymérase utilise un ddNTP au lieu d'un dNTP, elle n'est plus capable de rajouter le moindre nucléotide à sa suite : la synthèse du brin d'ADN s'arrête.

Nucléotides

A un moment aléatoire, un ddNTP sera ajouté à la chaîne en cours de synthèse par l'ADN polymérase. Cette synthèse s'arrêtera à cet endroit.
On réalise la polymérisation dans 4 tubes correspondant chacun à un ddNTP différent.
Par exemple, si le milieu réactionnel contient une faible proportion de didésoxyribonucléotide à Guanine (ddGTP), on obtiendra à la fin des réactions un ensemble de brins d'ADN de tailles variés, selon l'endroit où un ddGTP se sera inséré et que la réaction aura ainsi été stoppée (ce qui correpond, du fait de la complémentarité des bases, à la présence d'une Cytosine dans le brin d'ADN séquencé). On répète la même opération avec un milieu contenant du ddATP, un milieu contenant du ddCTP, et un milieu contenant du ddTTP.

Automatisation du séquençage
Adaptation de la méthode de séquençage à la fluorescence

Au lieu du marquage radioactif, chaque ddNTP (ddATP,ddTTP,ddCTP,ddGTP) est marqué par un fluorochrome différent dont le spectre d’émission est spécifique. Une analyse spectrale va différencier les différents fluorochromes, associer la base correspondante et donc définir la séquence nucléotidique du brin d’ADN initial. Les brins allongés se terminent par un didéoxynucléotide marqué par un fluorochrome différent selon la base présente (A,T,C, G ).
La taille des fragments obtenus est déterminée par une chromatographie d'exclusion au lieu de l'électrophorèse. Le séquenceur détecte la florescence sortant des colonnes de chromatographie (4 colonnes), repérant les fragments d'ADN et leurs tailles précises. Les systèmes les plus modernes permettent même de lire les quatres nucléotides à partir d'une seule colonne de chromatographie.

ADN Séquenceur

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Automatisation du séquençage (suite)


La chromatographie d'exclusion va permettre le piegeage de particules de faible poids
moléculaire sur une colonne Sephadex G50 constituée de billes perforées dont les trous ont un diametre determine (ici de 20 a 50 µm). Les petites particules de diamètre inferieur à ceux-ci entrent et sont piégées. A l'inverse, les molécules de grande taille vont passer autour et seront éluées très rapidement.
Les produits de la reaction de polymérisation sont purifiés par chromatographie pour pieger les ddNTP libres (taille faible), en excès. En effet ces ddNTP libres non incorpores lors de la reaction pourraient parasiter les signaux de fluorescence specifiques. De même, les sels eventuellement présents sont piégés de la même manière que les ddNTP. Le résultat est présenté par la machine sous forme de courbes montrant la fluorescence détectée (et l'équivalent en terme de nucléotides).

">DNA sequencing Sanger

Les séquences écrites en ligne sont envoyées sur Internet et comparées à des séquences déposées dans des banques de données. Des BLAST sont ainsi obtenus, c’est à-dire des comparaisons avec les séquences les plus proches.

Sequencing. DNA alignement

Ainsi, pour le cas des ARNr, la banque RDP (Ribosomal Database Project II) a été développée afin de répondre à la demande croissante d'analyse à haut débit des séquences d'ARNr.


Phylogénie moléculaire par PCR-RFLP entre Homme, Chimpanzé, Gorille et Orang-Outan. Exemple introductif


Au lieu du séquençage, on utilise une PCR-RFLP. Le fragment d'ADN étudié est dans un premier temps amplifié par PCR, avant d’être soumis à l'hydrolyse par une enzyme de restriction.

Exemple d'étude

Les gènes BRCA-1 et 2 (pour "BReast CAncer" ou cancer du sein) sont présents chez tous les mammifères et sont responsables de la régulation des cycles de division cellulaire. Les gènes BRCA-1 et BRCA-2, situés sur les chromosomes 17 et 13, respectivement, inhibent la division cellulaire anarchique. Ils jouent le rôle de gènes suppresseurs de tumeurs. Certaines mutations de ces gènes peuvent accroître le risque de développement d'un cancer du sein.Etude chez les primates:

Primates

Technique moléculaire: RFLP, une seule enzyme de restriction

RFLP primates

Analyse RFLP Gène BRCA-1 sur gel d'agarose (E-gel 1,2% d'agarose)

Interprétation des résultats:

- Les profils de restriction RFLP ont été obtenus au moyen d'une seule enzyme de restriction.
- Les profils de l'homme et du chimpanzé sont identiques.
- Un seul fragment est commun entre les profils de l'Homme, du Chimpanzé et de celui du Gorille.

- Le profil de l'orang-outan est unique et ne présente aucun fragment en commun avec les trois autres espèces.

Conclusions:

- L'Homme partage un ancêtre commun plus proche avec le Chimpanzé qu'avec le Gorille et l'Orang-outan.

- Les Hominidés constitué de l'Homme et du Chimpanzé partage un ancêtre commun plus proche avec le Gorille que l'Orang-outan.


Primates. Arbre phylogénétique

Ouvrages de la préparation de la transition Secondaire-Supérieur


livre 'Sciences de la vie. Protéines et Enzymes', Baaziz 2013, 306 pages, ISBN : 978-99-54-32-663-3
+ DVD mis à jour + Assistance
Sciences de la vie. Protéines et Enzymes

sucres
Livre 'Structures et Métabolisme des sucres', M. Baaziz, 2018, 360 pages, 2018, ISBN : 978-9920-35-345-8 + DVD mis à jour + Assistance.
- Affiche
- Présentation du livre

Video 'genetic diversity through molecular markers' (master level, Cadi Ayyad University, 2019:



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Phylogénie moléculaire. Séquençage ADN