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Etude cinétique de l'invertase extraite de la levure boulangère et effet des inhibiteurs
دراسة حركية أنزيم أنفرتاز المستخلص من خميرة المخبز و تأثير المثبطات


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LIENS UTILES DU SITE

- Invertase. Introduction au travail pratique
- Aller aux tests de l'effet de la concentration du substrat (notion de Km et Vmax) et effets des inhibiteurs
QCM
- Faire un QCM sur l'invertase
- Faire un Contrôle temporisé et noté en enzymologie


VIDEO DU TP


NOUVEAU LIVRE

-Livre 'Structures et Métabolisme des Sucres', Baaziz, 2018(+ DVD, 400 QCM):
Sciences et vie, Biochimie
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تقــــــديم - Introduction


TELECHARGER POLYCOPIE TP INVERTASE (S4)
direction

L'invertase (أنزيم أنفرتاز) est une enzyme de la classe des hydrolases qui coupe la liaison glycosidique qui lie le glucose au fructose dans le sucre (glucide) de table, le saccharose (dissacharide) qui est un glucide non réducteur.---- Voir une introduction sur cette enzyme objet du travail pratique, les différents substrats et inhibiteurs possibles.
Lors du TP d'enzymologie S4 la cinétique de l'enzyme ainsi que ses paramètres cinétiques sont déterminés en absence et en présence d'inhibiteurs. Cours (Enzymologie: MOOC)
Cette partie du travail pratique est liée à deux autres parties:
- Introduction sur l'invertase dont les sources et les substrats catalysés.
- Effet de l'action de la concentration du substrat (notion de Km et Vmax) et des inhibieurs (notion de Ki).
--> Voir Vidéo du TP 'Extraction et étude cinétique de l'invertase de levure boulangère

يتعلق الأمر باستخلاص الجزء الذائب من خميرة المخبز، علما أن أنزيم الأنفرتاز موجود داخل الخلية، إذ يجب هدم الغشاء الخلوي. فيما بعد نستهدف استكشاف نشاط الأنفرتاز في المستخلص مع استخراج المعلمات الحركية للأنزيم (ثوابت Km و Vmax).

Il s'agit d'extraire la fraction soluble de la levure de boulangerie (Saccharomyces cerevisiae), sachant que l'invertase est une enzyme intracellulaire, son extraction nécessite obligatoirement la rupture de la membrane cellulaire.
Levure boulangère
L'objectif suivant est de mettre en évidence l'activité invertase dans l'extrait cellulaire et de déterminer les paramètres cinétiques de l'enzyme (Km et Vmax) ainsi que les conditions optimales pour son fonctionnement.


Mode opératoire


- Dans un mortier, suspendre 15 g de levure de boulangerie(Saccharomyces cerevisiae) dans 29 ml de tampon citrate de sodium 10 mM (pH 6,0) contenant du béta-mercaptoéthanol 10 mM. Y ajouter une petite cuillère de sable fin et broyer vigoureusement contre la paroi du mortier pendant 5 minutes
- Ajouter 1 ml de triton X-100 (détergent non ionique) et homogénéiser l'extrait (comparer les différents détergents).
- Transvaser le contenu du mortier dans un tube à centrifuger. Boucher le tube et agiter vigoureusement pour permettre au triton X-100 de solubiliser les lipides membranaires et libérer l'invertase membranaire.
- Centrifuger 15 minutes à 7000 g. On récupère le surnageant qui constitue l'extrait brut (extrait F). Conservé dans la glace, il est utilisé pour tester l'activité de l'invertase de la levure de boulangerie.
Pour les tests enzymatiques, on prépare à partir de l'extrait F une solution d'enzyme diluée 25 fois dans l'eau distillée. Cette solution est conservée dans la glace.
. Le principe du test d'activité enzymatique est basé sur le dosage des sucres réducteurs suite à leur action réductrice d'un produit chimique (le DNS) qui change de couleur, une fois réduit


مبدأ قياس السكريات المختزلة باستعمال
Principe du dosage colorimétriques des sucres réducteurs par DNS


في وسط قلوي و تحت التسخين، يختزل الكليكوز و الفريكتوز حمض 3,5-dinitrosalicylique ذو اللون الأصفر إلي حمض 3-amino-5-nitrosalicylique بلون أحمر برتقالي، حيث يمتص الضوء بموجة 540 نانومتر.

En milieu alcalin et à chaud, le glucose et le fructose réduisent l'acide 3,5-dinitrosalicylique (Jaune) en acide 3-amino-5-nitrosalicylique (rouge-orange) absorbant la lumière à 540 nm.


Sucres. Réduction DNS

Plus de détail sur le dosage des sucres réducteurs (gamme-étalon glucose)


Préparation de la gamme étalon de sucres réducteurs


L'hydrolyse du saccharose (disaccharide non réducteur) libère le glucose et le fructose, deux monosaccharides réducteurs (le fructose moins réducteur que le glucose) dont la concentration reste à déterminer. Pour doser ces sucres réducteurs libérés dans la solution invertie, on prépare d'abord une gamme étalon de sucres réducteurs (glucose + Fructose: saccharose hydrolysé). Ainsi, différents volumes d'un un mélange équimolaire de glucose et de fructose (saccharose hydrolysé) à concentrations connues, sont traités avec le DNS Réactif au 3,5-dinitrosalicylate (DNS) solution déjà préparée (5 g de DNS dans 100 ml NaOH 2N + 150 g de tartrate double de Na et K dans 300 ml d'eau. Mélanger et compléter avec de l'eau distillée jusqu'à 500 ml)à chaud (dans milieu alcalin).
On organise les tubes de la gamme étalon suivant le tableau ci contre. A son état réduit par les sucres, le DNS absorbe la lumière à 540 nm. Ainsi, on aura une gamme étalon (DO à 540nm = f(quantité de sucres réducteurs) utile pour évaluer la concentration en sucres réducteurs provenant de l'action de l'invertase et dont on connait uniquement l'absorption connue à 540 nm (DO à 540nm). Pour cela on prépare une série de 5 tubes numérotés de G0 à G4 contenant des quantités croissantes d'une solution étalon de saccharose hydrolysé à 10 mM (glucose 10 mM + fructose 10 mM) qu'on traitera avec le DNS suivant le tableau 


Sucres réducteurs. Dosage DNS

Après addition du DNS dans tous les tubes, agiter au vortex et incuber dans le bain-marie à 100°C pendant 5 minutes. Après incubation, refroidir les tubes à +4°C et ajouter dans chaque tube 4 ml d'eau distillée.
Après agitation des tubes au vortex, mesurer l'absorbance à 540 nm au spectrophotomètre. Le zéro d'absorbance est réglé à l'aide du tube 0, ne contenant pas de sucres réducteurs.


sucres. Doasage DNS

Spectrophotometrie et loi de beer Lambert :

-Exercice spectrophotométrie


Remarque: Toutes les opérations commençant par l'addition de DNS jusqu'à la lecture de l'absorbance, seront à refaire de la même façon pour le dosage des sucres réducteurs libérés dans les milieux réactionnels des tests suivants (voir tableau ci dessus pour le cas de l'expérience vi = f(temps).
Représenter graphiquement sur papier millimetré, l'absorbance à 540 nm en fonction de la quantité de sucres réducteurs, exprimée em µmoles, dans chaque tube. La gamme-étalon (droite) servira pour déterminer la quantité de saccharose hydrolysée par l'invertase dans les réactions enzymatiques suivantes. Voir un exemple de courbe de la gemme étalon.


Cinétique d'hydrolyse du saccharose en fonction du temps par l'invertase de l'extrait brut F et détermination des vitesses initiales (vi) pour une concentration définie de substrat


Cette expérience est réalisée selon le tableau ci dessus.
Invertase. Vitesse initiale


- Suivant l'ordre du tableau, remplir tous les tubes avec le Saccharose 0,3 M (substrat de l'enzyme) et le tampon acétate 0,1 M.
- Pour le tube témoin (tube 0), l'ajout de l'extrait d'invertase est précédé par l'addition du DNS. Ceci permet l'arrêt immédiat de la réaction, car la solution de DNS a un pH très basique (voir composition de la solution de DNS), ne permettant pas le démarrage de la réaction.
- Disposer tous les tubes dans un bain-marie à 30°C.
- A l'aide d'une pipette, prélever 6 ml d'extrait F dilué et au temps 0 (utiliser un chronomètre), ajouter rapidement dans chaque tube 1 ml de l'extrait F dilué, agiter les tubes et laisser incuber au bain-marie à 30°C. Remarque: ici, on déclenche la réaction par addition de l'enzyme. Dans d'autres situations, la réaction peut être déclenchée par ajout du substrat
- Après 2 minutes d'incubation, retirer le tube N°1, ajouter 1 ml de DNS (arrêt de la réaction) et agiter vigoureusement au vortex. Déposer le tube hors bain-marie, à côté du tube témoin. Refaire la même opération pour les tubes 2, 3, 4 et 5 après 4, 6, 8 et 10 minutes d'incubation, successivement.
-Mettre tous les tubes, en même temps, dans le bain-marie à 100°C et laisser incuber 5 minutes.
- Refroidir et compléter tous les tubes, comme indiqué dans le tableau.
- A l'aide d'un spectrophotomètre, régler le zéro d'absorbance de la lumière à 540 nm en utilisant le tube témoin (tube 0). Mesurer les absorbances des autres tubes à la même longueur d'onde.
Que se passe-t-il dans les tubes lors du chaffage à 100°C en présence du DNS (milieu alcalin)?.
La réaction enzymatique catalysé par l'invertase génère 2 hexoses différents (Saccharose + H2O ---- D-Glucose (dextrose) + D-Fructose (levulose). Le glucose (aldohexose) est un sucre réducteur. Par contre, le fructose (cétohexose) présente un faible pouvoir réducteur. Ce pendant, dans un milieu alcalin et en présence du chauffage (100°C) le fructose subit l'isomérisation en glucose (voir figure) et permet de doubler le taux de sucres réducteurs prduits. Voir aussi interconversion.


Isomérisation fructose-glucose

Détermination de la vitesse initiale de la réaction enzymatique catalysée par l'invertase.

- A l'aide de la gamme étalon du dosage des sucres réducteurs, préalablement tracée, déterminer par projections des valeurs de DO sur la droite (gamme étalon), les quantités (µmoles) des sucres résultant de l'action de l'invertase sur le saccharose après 2, 4, 6, 8 et 10 min d'incubation à 30°C.

- Tracer la courbe représentant la quantité de sucres réducteurs (en µmoles) en fonction du temps d'incubation. A l'aide du tracé de la tangente, en déduire la vitesse initiale (vi) de la réaction en µmoles de sucres réducteurs libérés par minute .

-  Calculer la vitesse initiale en µmoles de saccharose hydrolysé par minute (unité, U) pour la concentration de saccharose utilisée dans l'essai. Déterminer le nombre d'unités contenu dans 1 ml d'extrait F non dilué.


Invertase. Vitesse initiale

Remarque.
Pour raison de commodité (réduire le temps des tests), on déterminera les vitesses initiales des réactions suivantes en adoptant un seul temps d'incubation de l'enzyme avec le substrat, fixé à 5 minutes. La quantité de saccharose hydrolysé sera donc divisée par 5 pour trouver la vitesse initiale (vi) en µmoles de saccharose hydrolysé par minute.


Effet de la concentration de l'enzyme sur la vitesse initiale


La concentration de l'enzyme a un effet sur la vitesse initiale déterminée pour une concentration précise du substrat (voir la figure ci dessous illustrant un exemple de cinétiques obtenues avec 3 concentions d'une invertase)
vitesse initiale
En général, la méthode de détermination des vitesses initialesdoit être bien étudiée afin d'assuer une corrélation (linéarité) entre la concentration en enzyme et la vitesse initiale. Ceci est important pour avoir plus de précision dans la détermination des paramètres Km et Vmax pour un substrat donné.


Aller aux tests de l'effet de la concentration du substrat (notion de Km et Vmax) et effets des inhibiteurs
direction

LIENS UTILES:
- Faire un Contrôle temporisé et noté en enzymologie
- Faire un Contrôle temporisé et noté sur l'invertase (TP) - Faire un QCM sur l'invertase


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