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Détermination des paramètres cinétiques (Km et Vmax) de l'invertase de la levure boulangère et effet des inhibiteurs


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LIENS UTILES DU SITE

- Invertase. Préparation à partir le la levure boulangère
- Aller aux tests de l'effet de la concentration du substrat (notion de Km et Vmax) et effets des inhibiteurs
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- Faire un QCM sur l'invertase
- Faire un Contrôle temporisé et noté en enzymologie


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Sciences et vie, Biochimie
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تقــــــديم - Introduction


Cette partie du travail pratique est précédée par les parties:
- Introduction sur l'invertase dont les sources et les substrats catalysés.
- Extraction de l'invertase et le test de sa cinétique par dosage des sucres réducteurs libérés suite à l'hydrolyse du saccharose.


Etude de l'influence de la concentration en substrat sur la vitesse de réaction et effet du sulfate de cuivre sur l'invertase et détermination des paramètres cinétiques Km et Vmax en présence et en absence d'inhibiteur.


L'influence de la concentration du sbstrat (saccharose) et l'effet du sulfate de cuivre sont étudiés sur la même série d'expérience. En plus d'un tube témoin (tube 0), on teste l'influence de 4 concentrations de saccharose correspondant à 4 volumes différents (0,2 ml, 0,3 ml, 0,4 ml et 0,6 ml) d'une solution mère de saccharose 100 mM. Le tube témoin contient 1 ml d'eau à la place du saccharose (tube 0).
Le test est répété deux fois, avec les mêmes concentrations de substrat, mais en ajoutant séparément 0,2 ml et 0,4 ml d'une solution de sulfate de cuivre de concentration égale à 15 mM. Pour réaliser cette expérience on utilise 13 tubes numérotés de 0 à 12. Ils sont préparés selon les 3 tableaux suivants:


cinétique +/- inhibiteur

- Calculer les concentrations finales du saccharose dans chaque tube (3 ml de mélange réactionnel).

-  Calculer les concentrations finales du sulfate cuivre dans chaque tube (3 ml de mélange réactionnel).


- A l'aide de la gamme étalon du dosage des sucres réducteurs, déterminer les quantités (µmoles) de ces sucres résultant de l'action de l'invertase sur le saccharose en absence de CuSO4 (tube 1 au tube 4) et en présence des deux concentrations de sulfate de cuivre (tube 5 au tube 12). En déduire la quantité de saccharose hydrolysé en µmoles pour chaque tube.

- Sachant que la réaction d'hydrolyse du saccharose a duré 5 minutes, déterminer la vitesse initiale (vi) en µmoles de saccharose hydrolysé par minute pour chaque concentration finale de saccharose, en absence et en présence de CuSO4.

-  Organiser les vitesses obtenues dans un tableau à entrée double. Placer horizontalement, les concentrations finales en saccharose des 12 tubes (numérotés 1 à 12). Verticalement, placer les concentrations finales en CuSO4, y compris la concentration 0 mM. Le tableau final sera à 36 cases devant être remplies par les vitesses initiales correspondantes. Dans un tableau similaire, on peux organiser les données en faisant mention des inverses des concentrations (1/(S)) et les inverses des vitesses initiales (1/vi).
- Sur le même graphique, tracer les trois lcourbes 1/vi = f(1/(S)) ou ou représentation de Linweaver-Burk (voir les autres représentations possibles), montrant les activité de l'invertase en absence de sulfate de cuivre ((CuSO4) = 0 mM) et en présence de cet inhibiteur (avec deux concentrations). En déduire les valeurs de Vmax et Km de l'invertase de la levure de boulangerie en absence et en présence du sulfate de cuivre. Comparer l'affinité de l'invertase vis-à-vis du saccharose en absence et en présence de CuSO4.

-  Quel type d'inhibition exerce le sulfate de cuivre vis-à-vis du saccharose pour affecter l'activité de l'invertase de levure de boulangerie ? Justifier vos réponses.


inibiteur non compétitif


The presence of heavy metal ions such as Cu2+ may inhibit the activity of invertase. This is due to the high affinity of the sulfhydryl group on cysteine and methionine residues in a protein for the Cu2+ ion.


Inhibition de l'invertase par de fortes concentrations en substrats (saccharose) due au manque d'eau (augmentation de la viscosité)

Remarque: d'après Asare-Brown & Bullock, 1988, Biochemical education 16 (2), p. 98: 'At 40°C, a marked depression of invertase activity at sucrose concentrations above 0.3 M is apparent (Fig). At the higher sucrose concentrations, the reaction medium becomes highly viscous and regular agitation to ensure mixing is vital to obtain consistent results. The inhibition is temperature dependent, and an investigation to find the optimum temperature/substrate concentration combination is an interesting class exercise'.
Substrate inhibition of invertase has been attributed to both increased viscosity and changes in the activity of water associated with concentrated sucrose solutions (Invertase = hydrolase). However, Combes and Manson demonstrated that artificially increasing the viscosity of dilute sucrose solutions, using reagents such as carboxymethyl- cellulose, had no significant effect on invertase activity. Conversely, the use of reagents known to have a high affinity for water such as poly(1,2-ethanediol), resulted in a marked depression of activity, suggesting that water activity is in fact the key factor
'


invertase. Substrate inhibition

----> Revenir aux parties:
- Introduction sur l'invertase dont les sources et les substrats catalysés.
- إستخلاص أنزيم الأنفرتاز من خميرة المخبز
Extraction de l'invertase à partir de la levure boulangère et test de l'activité enzymatique (TP)

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