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Techniques
de séparation et d'analyse. Chromatographie.
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Le terme 'chromatographie' ('chromatography', en anglais) vient du Grec 'Khrôma' = couleur et 'Graphein' = écrire) implique une serie de techniques reliées par un principe commun: la migration différentielle des substances à séparer à travers une phase solide poreuse (phase fixe), sous l'impulsion d'un fluides vecteur (phase mobile). Plusieurs variantes de cette technique peuvent se présenter. |
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La chromatographie sur papier appartient aux chromatographies de partages. Elle est apparue vers 1944. La séparation des composés d'un mélange est due aux différences de solubilité. Tout dépend du coefficient de partage des composés dans 2 solvants, c'est à dire de leur affinité pour les solvants dont l'un constitue la phase stationnaire et l'autre la phase mobile (critère de polarité). La phase stationnaire est retenue sur un support solide (papier (contenant un solvant polaire = eau) ou gel). Les composés plus solubles dans la phase aqueuse se déplacent lentement. Ceux qui sont soluble dans la phase organique migrent relativement plus vite. Le coefficient de partage (K) d'un composé entre les 2 phases correspond à: K = (concentration dans la ph. stationnaire)/(concentration dans la ph. mobile). La séparation des substances peut être aussi exprimée par l'indice Rf (reference front) correspondant (Rf = distance parcourue par une substance divisée par la distance parcourue par l'éluant. Le Rf est difficilement reproductible. C'est pour cela il est préférable de caractériser chaque substance par son indice Rx (Rx = distance parcourue par la substance divisée par la distance parcourue par un corps x pris comme référence). Vidéo:
chromatographie sur papier des acides aminés: |
Le support fixe joue un rôle primordial dans la chromatographie d'adsorption. Chaque composé du mélange à séparer migre plus ou moins vite à travers le support fixe relativement polaire (adsorbant). Il s'accumule dans une zone délimitée. Les composés peuvent être identifiés par leurs positions et leurs couleurs. Ensuite, ils peuvent être élués séparement. Les composés se séparent selon leur affinité pour la phase fixe suivant un mécanisme d'adsorption-désorption. L'oxyde d'aluminium est l'adsorbant le plus utilisé. Il est généralement contenu dans des tubes de verre disposés verticalement.
Exemple 1: séparation d'un mélage d'acides aminés. Dans une phase mobile constituée par un mélange de n-butanol-acide acétique-eau (3:3:1), les acides aminés peuvent être séparés dans l'ordre croissant de leur Rf. Par exemple: l'ordre: CYS, ARG, SER, GLU, ALA, TYR, MET et LEU. La révélation des des acides aminés sur papier est effectuée par pulvérisation de la ninhydrine sur le papier séché (jaune orangé). Exemple 2: séparation des pigments d'une feuille chlorophilienne. La séparation d'un extrait de feuilles chlorophyliennes préparé dans l'ether permet de visualiser dans l'ordre croissant de Rf, les pigments: chlorophylle b (vert), chlorophylle a (bleu-vert), xanthophylles (jaune clair) et carotènes Ecouter un commentaire sur la chromatographie sur papier Chromatographie bidimensionnelle: La première séparation (monodimensionnelle) est souvent améliorée par une deuxième chromatographie où le papier séché résultant de la première séparation est tourné de 90°C puis soumis à deuxième séparation en utilisant une autre phase mobile différente de la première. |
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La chromatographie sur couche mince appartient aux chromatographies de partage. Elle est apparue vers 1938. Etant une technique de haute sensibilité, elle est indiquée pour la micro-analyse d'extraits de faible volumes. Un faible volume d'extrait est déposé sur une plaque chromatographique dont la partie inférieure est immergée dans un solvant. Celui ci monte par capillarité le long de la plaque et entraine les composés de l'extrait à des vitesses différentes.
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Ces composés séparés sont rendus visibles par l'emploi de réactifs chimiques (exploit du crière de la polarité des molécules). Le choix des couches fixes dépend des composés à séparer. Ainsi les couches peuvent correspondre à la Silice, la Cellulose, l'Alumine, les Polyamides,...Les plaques sont généralement vendues avec leurs couches specifiées. Vidéo: chromatographie sur couche mince des lipides: |
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Chromatographie d'échange d'ions La chromatographies échangeuse d’ions se réalisent sur des résines (matrice insoluble) chargées électriquement. Elles servent à détecter et isoler les ions d’une même charge. Généralement, elles se font sur des colonnes ou résines sur lesquelles des groupements de charges positives ou négatives sont liées par covalence. Les composés à séparer (en solution) sont passées sur ces résines. Ils y adhèrent s'ils sont de charge opposée au support. La matrice insoluble porte des charges ioniques qui retiennent les molécules de charges opposées. Les matrices généralement utilisées pour séparer des protéines sont le DiEthylAminoEthyl Cellulose (DEAE-Cellulose) qui est chargé positivement (+) et la CarboxyMéthyl Cellulose (CM-Cellulose) et la Phosphocellulose qui sont chargées négativement (-) (séparation selon le critère de l'ionicité des molécules). Le premier cas donne lieu à une chromatographie échangeuses d'anions. Le second cas correspond à une chromatographie échangeuse de cations.
La force d'association entre les molécules chargées et la matrice dépend de la force ionique et du pH de la solution d'élution. Le passage sur la colonne d'une solution éluante, plus chargée que la résine entre en compétition avec la résine. Ceci permet de décrocher les éléments fixés. Ainsi, pour la chromatographie des acides aminés, ceux ci seront séparés en fonction de leur charge électrique. Les élués (non fixés à la colonne) seront ceux de même charge que la résine. Tandis que ceux de charge opposée seront fixés. Plus l’acide aminé a un pHi éloigné du pH du milieu, plus il sera acide ou basique par rapport à celui-ci, donc d’autant plus chargé. Il sera le premier à être élué ou fixé, s'il est ou n’est pas de même charge que la résine, respectivement. Chromatographie d'affinité C'est le type de chromatographie qui exploite comme crière de séparation la forme des molécules, derrière une affinité naturelle existant entre deux corps comme celle liant un antigène à un anticorps ou une enzyme à un inhibiteur,...
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