Electrophorèse. Aspect théorique

L'électrophorèse est une technique d'analyse et de séparation basée sur les critères de la charge électrique et la taille des molécules. La migration différentielle de particules chargées électriquement, se fait sous l'influence d'un champs électrique.

Seules les particules chargées positivement ou négativement sont attirées par les pôles opposés du champs électrique. Les composés qui peuvent être transformés en particules chargées par formation de complexes, sont de même sujets à une migration sous l'effet du champs électrique. Parmi les supports utilisés dans la technique d'électrophorèse, on note le gel de polyacrylamide donnant de bonnes résolutions lors de la séparation.

Le pH des solutions joue un rôle très important dans l'acquisition des charges électriques. Ainsi,dans le cas des protéines, le Ph auquel la charge électrique globale est nulle est appelé point isoélectrique.

Principe

Une protéine en solution portée à un pH inférieur à son PI, se comporte comme une base et  capte des protons H+. Elle devient chargée positivement.- Une protéine mise à un pH supérieur à son PI (point isoélectrique), se comporte comme un acide et cède des  protons . Elle sera chargée négativement. Prenons le cas d'un acide aminé A. Ses charges seront:

Déplacement électrophorétique.

Sous l'action d'un champs électrique, E, une protéine se déplace avec une vitesse, v, proportionnelle au champs:

v = µ E, avec µ  appelée 'mobilité électrophorétique' µ = v / E   (1)  avec : µ en cm2.s-1.volt-1, v en cm.s-1 et E en volt.cm-1
Le champs électrique (E) crée entre 2 électrodes, exerce une force, F, sur une protéine que l'on suppose sphérique et de charge q; F = q E

Les forces de frottement, F', dues à la viscosité (eta) vont s'opposer à la migration de la protéine et la freiner;

Donc, la mobilité d'une particule migrant dans un champs uniforme dépend de 3 facteurs : q, (eta) et r.

*Elle est inversement proportionnelle au coefficient de viscosité du milieu , (eta)

*Elle est inversement proportionnelle à son rayon (r).

- Electrophorèse horizontale
- Electrophorèse verticale

Les supports utilisés en électrophorèse sont nombreux, avec des degrés de résolution variables. Leurs types ont permis de distinguer plusieurs appellations en électrophorèse, comme : - Electrophorèse en veine liquide- Electrophorèse sur papier- Electrophorèse sur gels (agarose, amidon, polyacrylamide...).

وسط العزل (Support de migration).

يختلف وسط العزل (Support de migration) حسب نوعية الجزيئات المراد فرزها بالكهروتهجير. عند ظهور التقنية، كان في شكل سائل أو ورق، ثم تطور بعدها إلى شكل هلام (Gel) من نشا (Amidon) و أكاروز (Agarose) و بولي أكريلميد (Polyacrylamide).  يمتاز كل وسط عن الآخر بالدقة في الفرز و سهولة الاستعمال. غالبا ما تستعمل مادة الأكاروز في تركبة وسط عزل الأحماض النووية، زيادة عن مادة البولي أكريلميد و الذي يستعمل بكثرة في حالة فرز البروتينات.

Comment sont formés les gels de polyacrylamide ?

Les gels de polyacrylamides sont au départ des solutions liquides constituées d'un mélange d'acrylamide et du bis acrylamide (N,N'méthylène-bisacrylamide) qui réagissent entre eux pour former un gel réticulé suite au déclenchement d'une réaction de polymérisation initiée par le persulphate (fourni par le persulfate d'ammonium) et le le TEMED (N,N,N',N'-tétraméthyléthylènediamine). Le persulfate génère en présence du TEMED le radical sulfate (S., oxydant puissant). L'acrylamide (A) possédant une double liaison entre deux carbones, constitue une cible privilégiée pour le radical sulfate. Il en résulte une molécule d'acrylamide forme radical libre (A.). Celle ci attaque à son tour une deuxième molécule d'acrylamide, pour donner un nouveau radical libre. Les radicaux libres du polyacrylamide peuvent régir entre eux pour donner des polymères d'acrylamide ou polyacrylamide (A-A-An) qui est une chaîne linéaire de forme liquide et visqueuse. Pour arriver à un support d'électrophorèse sous forme de gel solide facile à manipuler, il devient nécéssaire de faire appel à un agent réticulant (cross linker). Le bisacrylamide (équivalent de 2 monomères d'acrylamide liés par un groupement méthyl), possédant deux sites d'attaque radicalaire (2 doubles liaisons entre atomes de carbone), constitue un agent de réticulation de choix. Ainsi, Il permet la formation de ponts entre les molécules d'acrylamide. Les gels obtenus ainsi sont caractérisés par un degré de réticulation bien précis (dépendant du pourcentage du bisacrylamide).Le e pourcentage C de Bis par rapport à l''acrylamide est: C = [poids (Bis)/ poids(acrylamide+Bis)]x 100.

Ce type d'électrophorèse peut être réalisé en utilisant des systèmes tampons dissociant ou non dissociant, continus ou non continus. L'agent dissociant le plus utilisé est le détergent anionique; Sodium Dodecyl Sulfate (SDS). Une fois fixé sur les protéines (à chaud) le SDS affecte une charge négative (-) à tous les polypeptides. Ces derniers migreront, donc, dans le gel de polyacrylamide selon leur taille, uniquement. Ainsi, l'experimentateur peut déterminer le poids moléculaire (PM) des différents polypeptides en se référant à la mobilité de polypeptides de PM connus (marqueurs de PM).Le système tampon non dissociant est recommandé pour l'électrophorèse de protéines natives, où l'interaction subunitaire, la conformation et l'activité biologique des protéines doivent être préservées. Dans ce cas, la séparation se fait sur la base de la charge et de la taille.Les systèmes tampons discontinus (multiphasiques) utilisent différents tampons à des Ph différents.

Exemple de systèmes tampon discontinus : le système d'Ornstein.

L'utilisation de tampons discontinus dans leur pH et la nature des ions, permet la concentration préalable de l'échantillon à séparer. Les gels de polyacrylamide répondant à cette condition, présentent 2 types de structures:
- Un gel de concentration (stacking gel).- Un gel de séparation (resolving gel).
L'utilisation en électrophorèse de gels de concentration et de séparation de concentrations en polyacrylamide non convenable peut aboutir à 2 situations différentes :

- Elimination des protéines incapables de pénétrer dans le gel, dans le cas des gels très concentrés.

- Absence de séparation des protéines de petite taille, migrant avec le front.

Entre ces 2 extrêmes, les protéines peuvent être résolues différemment selon la concentration en polyacrylamide du gel  de séparation:

Afin qu'elles puissent être détectées les molécules séparées par électrophorèse doivent être révélées par coloration ou traitements appropriés pour les rendre visibles.

Révélation des protéines par coloration sur gel

Lorsqu'il s'agit des protéines, celles ci sont généralement incolores. Leur visualisation sur les supports d'électrophorèse s'effectue par des procédés histochimiques qui permettent de colorer les produits de dénaturation de la protéine ou une partie chimique qui lui est associée. Exemples: coloration au bleu de coomassie et coloration par nitrate d'argent.

Révélation des protéines par mise en évidence d'une activité biologique (catalyse enzymatique)

Lorsque les protéines sont de nature enzymatique, la révélation peut être faite sur le gel par addition des substrats spécifiques d'une telle ou telle enzyme. Des exemples de gels révélés au laboratoire pour la détection du polymorphisme enzymatique (activité biologique) sont expliqués dans la partie pratique (voir TP isoenzymes).

الإستظهار (Révélation).

Extraction et Révélation des isoenzymes (vidéo)

La révélation in situ sur gel des protéines par réaction antigène-anticorps est coûteuse, car les protéines séparées restent " emprisonnées " dans le gel. Pour diminuer les quantités les coûts d'anticorps à ajouter pour révéler les protéines, il faut éluer les protéines du gel.

Transfert des protéines préalablement séparées sur gel, sur membrane (western blotting)

Les différentes protéines contenues dans le gel seront adsorbées sur un nouveau support (exemple: membrane de nitrocellulose). La formation de l'empreinte se dit blot en anglais d'où le nom western blot, western n'est qu'un mot en rapport avec la technique initiale du Southern blot conernant le transfert de l'ADN sur membrane de nitrocellulose ou nylon (technique inventée par Southern).

في حالات إستثنائية، يصبح إلزامي نقل محتويات وسط العزل (بروتينات أو أحماض نووية) إلى وسط من نوع آخر للتمكن من اكتشافهم. مثلا، من أجل اكتشاف البروتينات بالأجسام المضادة (Anticorps)، يتم نقلهم من الهلام (Gel) إلى غشاء مصنوع من النيتروسيليوز (Nitrocellulose). يتم وضع هذا الغشاء فوق الهلام، ووضع مجموعة من طبقات أوراق الترشيح فوق ذلك. ثم يتم وضع الطبقات كلها في محلول يقوم بالتنقل إلى الأعلى عبر الأوراق، جالباً البروتينات معه إلى الغشاء.  تسمى هذه الطيقة ب التلطيخ الغربي (بالإنجليزية: Western blotting).

Immunodétection

Après transfert sur membrane des protéines à partir du gel, celles ci sont révélées par immunodétection en utilisant un anticors préalabement préparé contre elles. La réaction de détection fait appel à un anricors secondaire marquée à la peroxydase qui tranforme un substrat de la réaction en un produit coloré visible.L'immunodétection (immunomarquage) est une des meilleures méthodes pour caractériser une protéine parmi d'autres protéines. La protéine (antigène) réagit avec les anticorps spécifiques (anticorps primaires). Une fois le complexe antigène-anticorps formé. Il est détecté grâce à un deuxième anticorps (anticorps secondaire, pouvant être marqué par une enzyme comme la peroxydase) qui détecte les emplacements où les anticorps primaires se sont fixés sur les antigènes (ptotéines) fixés à la membrane. Comme exemple, l'anticorps secondaire anti-IgG de lapin est lié (ou conjugué) de manière covalente à une peroxydase (POX) (comme l'enzyme HorseRadish Peroxidase, HRP). L'activité enzymatique est détectée grâce à une méthode de chimiluminescence pour trouver la position des complexes antigène-anticorps. 

Révélation des acides nucléiques

La révélation des acides nucléiques peut être faite par simple incubation des gels dans une solution de bromure d'éthidium ou par coloration au nitrate d'argent.

Lorsqu'on dispose d'une sonde marquée, on peut l'utiliser dans la révélation du DNA après transfert des produits séparés sur membrane de nitrocellulose (southern blotting). La détection des fragments de DNA se fait par hybrydation selon les appariement des bases A-T et C-G.

Les fragments de DNA séparés par électrophorèse sur gel peuvent provenir d'une digestion de DNA par une enzyme de restriction ou résulter une amplification de DNA par la Taq polymerase en utilisant une amorce précise 5polymérisation en chaîne du DNA ou PCR). La technique RAPD, basée sur la PCR, permet de révéler un polymorphisme de fixation d'amorces pouvant être utilisé dans le marquage des êtres vivants.

Effet de la composition ionique des tampons sur la séparation électrophorétique.
1/ Les tampons à faible force ionique entraînent a/ une migration rapide (donc diffusion faible), b/ un chauffage faible, c/ bandes moins résolues.
2/ Les tampons à force ionique élevée entraînent a/ une migration faible (donc diffusion élevée), b/ un chauffage élevé, c/ bandes plus résolues.
Les systèmes tampons sont choisis de façon à avoir une force ionique du tampon du gel inférieureà celle du tampon d'électrodes.
Les systèmes tampons sont choisis de façon à avoir une force ionique du tampon du gel inférieure à celle du tampon d'électrodes.
Les PI de la plupart des protéines se situent entre pH 4,0 et 7,0. Donc, les tampons à pH compris entre 8 et 9,5 sont souvent utilisés lors de l'électrophorèse des protéines.
Effet du mode de séparation ''voltage (V) constant' ou 'Intensité (I) constante':
Séparation à V constant: Si R augmente, I diminuera (car V = Rx I). Ceci entraîne dinimution du chauffage (lié à la puissance (P); P = I x I x R).
Séparation àI constante: la mobilité reste constante. Si R augmente, le chauffage augmentera (P augmente)