Gène - génie génétique

Après séquençage, on réalise la synthèse d'un oligopeptide correspondant à une partie de la séquence codante du gène. Cette opération est rendue possible grâce à des appareils pouvant synthétiser des oligopeptides d'environ 30 acides aminés (visualisation des acides aminés). Pour analyser le produit (gène), on procède à la purification de la protéine par chromatographie d'affinité en utilisant un anticorps monoclonal préparé contre l'oligopeptide préalablement synthétisé ( voir schéma récapitulatif ci dessous).

VOIE PROTEINE ---> GENE
Cette fois, la protéine est purifiée. Néanmoins, son gène reste inconnu. La protéine sera analysée par électrophorèse bidimensionnelle. Seuls qeulques nanogrammes de la protéine peuvent être élués du gel ayant servi de support d'électrophorèse. La protéine isolée peut être séquencée grâce à des appareils automatiques pouvant analyser jusqu'à 10 picomoles de protéines. La séquence obtenue peut être comparée à d'autres séquences des banques de données d'oligopéptides. Les séquences oligonucléotidiques correspondantes seront déterminées. Aussi, le mélange d'oligonucléotides déduit peut être fabriqué à l'aide de machines automatiques. Les différents oligonucléotides sont utilisés comme sondes moléculaires pour rechercher les séquences complémentaires dans une banque de clones de cADN ou de clones génomiques ( voir schéma récapitulatif ci dessous).

OUTILS CELLULAIRES ET MOLECULAIRES DU GENIE GENETIQUE

Le génie génétique utilise des outils cellulaires et moléculaire.

I/ OUTILS CELLULAIRES. L'isolement et l'amplification d'un gène impose son clonage et sa multiplication dans des cellules de procaryotes (bactéries) ou d'eucaryotes pouvant être mises en culture in vitro. Ces cellules peuvent être réimplantées dans un embryon ou un organisme entier. Aussi, le ADN peut être injecté dans un oeuf qui donnera un nouvel animal une fois réimplanté dans un individu femelle. De façon générale, l'isolement et l'amplification d'un gène se réalisent souvent dans une bactérie.

II/ VECTEURS. Le transfert des gènes vers d'autres organismes nécessite un vecteur capable de se transferer dans une cellule cible et de s'autorépliquer. Les vecteurs sont des fragments de ADN contenant une origine de réplication (réplicon). Ils peuvent correspondre à:

1/ Episomes ou Plasmides spécifiques des bactéries (voir Animation).
2/ Episomes ou virus à ADN des cellules eucaryotes.
3/ Virus à ARN pouvant s'intégrer sous l'état de ADN proviral dans le ADN des cellules eucaryotes.
4/ Bactériophages (virus des bactéries) se multipliant dans les bactéries.

III/ ENZYMES DE SYNTHESE ET DE MODIFICATION DES ACIDES NUCLEIQUES. Les enzymes de synthèse de ADN les plus utilisées sont les enzymes de restrictiction (endonucléases) reconnaissant une séquence de 4-6 paires de nucléotides dans le ADN. Ces 'enzymes-ciseaux' peuvent couper le ADN en plusieurs fragments de tailles différentes. Les coupures de ADN génèrent des bouts collants (après coupures 'de travers') ou non (après coupures franches). Des enzymes de synthèse de ADN in vitro sont impliquées dans les grandes opérations du génie génétique. Il s'agit d'abord de la ADN polymerase (ADN pol. I de Kornberg) qui est capable de synthétiser un ADN bicaténaire à partir d'un ADN monocaténaire contenant une amorce ('primer') avec une extrémité 3'OH libre. Une deuxième enzyme; la transcriptase reverse; capable de synthétiser du ADN à partir du ARN (ADN polymérase ARN dépendante) est impliquée dans la fabrication d'un ADN bicaténaire à partir d'un ARN. Le deuxième brin du ADN est synthétisé simultanément avec l'élimination du ARN par la ribonucléase H associée à la même enzyme (QCM-expression des gènes)

Les modifications des acides nucléiques utilisées en génie génétique sont de deux types; des modifications internes au ADN et des modifications aux extrémités. Le premier type de modifications consiste à des méthylations par des méthylases conceARNnt une cytosine (C) ou une adénine (A). Le deuxième type de modifications a pour but l'addition ou l'élimination de nucléotides aux deux extrémités du ADN. La désoxynucléotidyl transférase terminale permet la synthèse d'une 'queue' d'oligo X aux deux extrémités 3' du ADN. La kinase et la phosphatase peuvent respectivement fixer ou éliminer un phosphate sur les deux extrémités 5' d'un ADN double brin permettant ainsi aux deux fragments de ADN d'être liés ou séparés. Des ligases permettent de relier les extrémités franches (ligases du bactériophage T4) ou les extrémités à bouts collants (ligase d'E.coli) résultant de l'action des enzymes de restriction sur le ADN.

Transformation des bactéries
Les transformations bactériennes peuvent être réalisées par un ADN total bactérien, un plasmide et un bactériophage. La transfection des bactéries par un plasmide, couramment utilisée en génie génétique, permet le transfert des gènes portés par le plasmide (exemple de la résistances à des antibiotiques). La transfection par bactériophage (virus bactérien) consiste en une injection du ADN viral dans la bactérie où il se réplique. Parfois, ce ADN s'intègre dans le ADN bactérien sous forme de prophage. La bactérie porteuse du prophage (bactérie lysogène) peut acquérir un nouveau caractère donné par le bactériophage.

Transformation des cellules eucaryotes
Les cellules eucarotes maintenues en cultures peuvent être transformées par 4 moyens différents; addition d'un ADN porteur d'un gène, transfection par ADN viral, transformation par fusion cellulaire et transfert de gènes par microinjection de ADN dans un noyau cellulaire.

La transformation de cellules eucaryotes par du ADN consiste à cloner en présence d'un ADN porteur d'un gène précis, des cellules obtenues à partir de tissus permettant d'obtenir des lignées cellulaires en culture in vitro.
La transfection de cellules eucaryotes par du ADN viral d'origine animale ou végétale, a pour objectif l'augmentation de l'efficacité du transfert du ADN dans les cellules. Le ADN viral peut s'intégrer dans le ADN cellulaire sous forme de provirus et donne à la cellule de nouveaux caractères, comme l'induction de tumeurs.
La transformation de cellules eucaryotes par fusion cellulaire donnant des hybridomes (cellules hybrides), est un autre moyen de transfert de gènes d'une cellule à une autre. Après plusieurs générations, les cellules hybrides peuvent perdre certaines parties du génome (chromosomes,...) et donnent lieu à des phénotypes différents où certains gènes peuvent être localisés sur des chromosomes précis.
La transformation de cellules eucaryotes par microinjection de ADN dans le noyau cellulaire permet le transfert de gènes qui s'intègrent de façon stable dans le génome de cellules maintenues en culture.

2.6. Clonage d'un gène
La recombinaison in vitro d'un ADN porteur de gènes qui seront clonés dans des cellules est une des technologies de base du génie génétique. Quatre étapes principales peuvent être distinguées dans la purification d'un gène par génie génétique. Elles concernent les sources du ADN à cloner, l'insertion du ADN dans un vecteur, le clonage du ADN recombiné dans une cellule en culture et l'identification du clone cellulaire ou du virus contenant le ADN recombinant.

2.6.1. SOURCES DU ADN SUJET AU CLONAGE
ADN de synthèse chimique: le principe consiste à relier des nucléotides d'enchaînement connu en fixant un trinucléotide sur un support comme le sépharose et en ajoutant d'autres trinucléotides présynthétisés. Une fois détachée de son support, la chaîne des désoxyribonucléotides servira de matrice pour synthétiser le brin de ADN complémentaire. Ainsi, des ADN double brins de plus de 50 paires de bases ont pu être synthétisés. La synthèse chimique de ADN à cloner concerne des petits fragments de ADN ('petits gènes')comme ceux des gènes des neuropeptides.
ADN synthétisé à partir de ARN messager (mARN): un mARN contenant le polyA ou un mARN purifié peuvent servir de matrice pour la synthèse de ADN par une transcriptase réverse (ADN polymrase ARN dépendante) de virus. Cette synthèse nécessite une amorce (primer) comme oligo dT. Le ADN obtenu correspond à une partie du gène. Ainsi, des ADN (cADN) de 2000 paires de bases ont pu être synthétisés à partir de mARN. mARN ne contenant pas d'introns (séquences non codantes), le ADN lui correspondant par synthèse ne contient que des gènes avec uniquement leurs exons (séquences codantes). Animation, quiz: Formation du cADN

ADN obtenu à partir du ADN génomique d'une cellule:Le ADN génomique d'une cellule provient d'une digestion par une ou plusieurs enzymes de restriction. Contrairement au cADN synthétisé à partir du mARN, le ADN génomique peut contenir des gènes entiers (exons + introns). La coupure du ADN par des enzymes de restriction produit des extrémités se recombinant facilement avec d'autres fragments de ADN comme ceux des ADN vecteurs. Atitre d'exemple, l'enzyme de restriction EcoRI coupe le ADN d'une cellule animale en un million de fragments de longueurs différentes (quelques dizaines à plusieurs milliers de paires de bases).

INSERTION DU ADN SUJET AU CLONAGE DANS UN VECTEUR
Le ADN synthétisé chimiquement ou à partir des mARN ainsi que les fragments de ADN génomique doivent être portés par un vecteur capable de se répliquer et d'être transféré dans une cellule. Pour assurer cette recombinaison in vitro, il est nécessaire d'assurer une préparation préalable du ADN à cloner et du ADN vecteur. La stratégie suivie est leurs coupures par la même enzyme de restriction. Les extrémités collantes des deux ADN se reconnaitront. Elles seront soudées par une ligase. Ainsi, des molécules hybrides (vecteur + ADN à cloner) seront reconstituées. Si cette méthode ne donne pas de résultats satisfaisants, il faudra faire appel à des modifications des extrémités des ADN. Ainsi, des queues oligo dG (20 dG) et d'oligo dC (20 dC) peuvent être ajoutées respecticement au ADN vecteur et au ADN à inserer. Par appariement des deux séquences, le ADN à cloner sera inséré dans le ADN vecteur. Une autre stratégie valable pour le ADN génomique consiste à attacher au ADN à insérer un décamère synthétique (linker) avec digestion par des enzymes de restriction correspondant au site de coupure du ADN vecteur.

CLONAGE DU ADN RECOMBINE DANS UNE CELLULE EN CULTURE
Le ADN hybride recombiné et le ADN non recombiné résultant de l'étape du clonage dans un vecteur, seront introduits 1) soit dans des bactéries par transfert (plasmide) ou par infection (bactériophage), 2) soit dans une cellule eucaryote en culture par transfection ou par infection avec un virus à ADN.
Le plasmide recombinant transféré dans les bactéries s'autorépliquera facilement. Les colonies bactériennes le contenant peuvent être isolées. Quant au bactériophage recombinant, il se reproduit en lysant les bactéries. On isolera des plages de lyse. Le ADN recombiné peut être cloné dans une cellule en culture. La fusion cellulaire et la précipitation des cellules avec le ADN (par utilisation du phosphate de calcium) permettent la transfection du ADN recombinant. On obtient des cellules transformées.

IDENTIFICATION DU CLONE CELLULAIRE OU DU VIRUS CONTENANT LE ADN RECOMBINANT
L'identification du clone cellulaire exige l'utilisation de marqueurs de sélection ou de procédés d'hybridation adaptés.
Les marqueurs de sélection sont associés au vecteur ou au fragment de ADN à détecter.Ainsi, la résistance aux antibiotiques liée aux gènes portés par les plasmides bactériens est un marqueur de la présence d'un plasmide recombinant.
L'hybridation du ADN recombinant avec un fragment de ADN ou de ARN comlémentaire permet d'identifier le clone désiré dans un mélange hétérogène. Le ADN des clones bactériens est hybridé in situ avec le ADN sonde marqué radioactivement.


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Gène et bases du génie génétique
Le génie génétique qui conduit aux transformations génétiques s'opérant sur l'ADN, s'appuie sur un ensemble d'outils cellulaires et moléculaires dont le clonage d'un gène. VOIE GENE ---> PROTEINE Après isolement d'un gène précis dans une banque de cADN ou une banque génomique on procède à son séquençage et son analyse. La détermination des séquences de nucléotides se fait par les techniques de Maxam et Gilbert ou de Sanger. Après séquençage, on réalise la synthèse d'un oligopeptide correspondant à une partie de la séquence codante du gène. Cette opération est rendue possible grâce à des appareils pouvant synthétiser des oligopeptides d'environ 30 acides aminés (visualisation des acides aminés). Pour analyser le produit (gène), on procède à la purification de la protéine par chromatographie d'affinité en utilisant un anticorps monoclonal préparé contre l'oligopeptide préalablement synthétisé ( voir schéma récapitulatif ci dessous). VOIE PROTEINE ---> GENE Cette fois, la protéine est purifiée. Néanmoins, son gène reste inconnu. La protéine sera analysée par électrophorèse bidimensionnelle. Seuls qeulques nanogrammes de la protéine peuvent être élués du gel ayant servi de support d'électrophorèse. La protéine isolée peut être séquencée grâce à des appareils automatiques pouvant analyser jusqu'à 10 picomoles de protéines. La séquence obtenue peut être comparée à d'autres séquences des banques de données d'oligopéptides. Les séquences oligonucléotidiques correspondantes seront déterminées. Aussi, le mélange d'oligonucléotides déduit peut être fabriqué à l'aide de machines automatiques. Les différents oligonucléotides sont utilisés comme sondes moléculaires pour rechercher les séquences complémentaires dans une banque de clones de cADN ou de clones génomiques ( voir schéma récapitulatif ci dessous). OUTILS CELLULAIRES ET MOLECULAIRES DU GENIE GENETIQUE Le génie génétique utilise des outils cellulaires et moléculaire. I/ OUTILS CELLULAIRES. L'isolement et l'amplification d'un gène impose son clonage et sa multiplication dans des cellules de procaryotes (bactéries) ou d'eucaryotes pouvant être mises en culture in vitro. Ces cellules peuvent être réimplantées dans un embryon ou un organisme entier. Aussi, le ADN peut être injecté dans un oeuf qui donnera un nouvel animal une fois réimplanté dans un individu femelle. De façon générale, l'isolement et l'amplification d'un gène se réalisent souvent dans une bactérie. II/ VECTEURS. Le transfert des gènes vers d'autres organismes nécessite un vecteur capable de se transferer dans une cellule cible et de s'autorépliquer. Les vecteurs sont des fragments de ADN contenant une origine de réplication (réplicon). Ils peuvent correspondre à: 1/ Episomes ou Plasmides spécifiques des bactéries (voir Animation). 2/ Episomes ou virus à ADN des cellules eucaryotes. 3/ Virus à ARN pouvant s'intégrer sous l'état de ADN proviral dans le ADN des cellules eucaryotes. 4/ Bactériophages (virus des bactéries) se multipliant dans les bactéries. III/ ENZYMES DE SYNTHESE ET DE MODIFICATION DES ACIDES NUCLEIQUES. Les enzymes de synthèse de ADN les plus utilisées sont les enzymes de restrictiction (endonucléases) reconnaissant une séquence de 4-6 paires de nucléotides dans le ADN. Ces 'enzymes-ciseaux' peuvent couper le ADN en plusieurs fragments de tailles différentes. Les coupures de ADN génèrent des bouts collants (après coupures 'de travers') ou non (après coupures franches). Des enzymes de synthèse de ADN in vitro sont impliquées dans les grandes opérations du génie génétique. Il s'agit d'abord de la ADN polymerase (ADN pol. I de Kornberg) qui est capable de synthétiser un ADN bicaténaire à partir d'un ADN monocaténaire contenant une amorce ('primer') avec une extrémité 3'OH libre. Une deuxième enzyme; la transcriptase reverse; capable de synthétiser du ADN à partir du ARN (ADN polymérase ARN dépendante) est impliquée dans la fabrication d'un ADN bicaténaire à partir d'un ARN. Le deuxième brin du ADN est synthétisé simultanément avec l'élimination du ARN par la ribonucléase H associée à la même enzyme (QCM-expression des gènes) Les modifications des acides nucléiques utilisées en génie génétique sont de deux types; des modifications internes au ADN et des modifications aux extrémités. Le premier type de modifications consiste à des méthylations par des méthylases conceARNnt une cytosine (C) ou une adénine (A). Le deuxième type de modifications a pour but l'addition ou l'élimination de nucléotides aux deux extrémités du ADN. La désoxynucléotidyl transférase terminale permet la synthèse d'une 'queue' d'oligo X aux deux extrémités 3' du ADN. La kinase et la phosphatase peuvent respectivement fixer ou éliminer un phosphate sur les deux extrémités 5' d'un ADN double brin permettant ainsi aux deux fragments de ADN d'être liés ou séparés. Des ligases permettent de relier les extrémités franches (ligases du bactériophage T4) ou les extrémités à bouts collants (ligase d'E.coli) résultant de l'action des enzymes de restriction sur le ADN. Transformation des bactéries Les transformations bactériennes peuvent être réalisées par un ADN total bactérien, un plasmide et un bactériophage. La transfection des bactéries par un plasmide, couramment utilisée en génie génétique, permet le transfert des gènes portés par le plasmide (exemple de la résistances à des antibiotiques). La transfection par bactériophage (virus bactérien) consiste en une injection du ADN viral dans la bactérie où il se réplique. Parfois, ce ADN s'intègre dans le ADN bactérien sous forme de prophage. La bactérie porteuse du prophage (bactérie lysogène) peut acquérir un nouveau caractère donné par le bactériophage. Transformation des cellules eucaryotes Les cellules eucarotes maintenues en cultures peuvent être transformées par 4 moyens différents; addition d'un ADN porteur d'un gène, transfection par ADN viral, transformation par fusion cellulaire et transfert de gènes par microinjection de ADN dans un noyau cellulaire. La transformation de cellules eucaryotes par du ADN consiste à cloner en présence d'un ADN porteur d'un gène précis, des cellules obtenues à partir de tissus permettant d'obtenir des lignées cellulaires en culture in vitro. La transfection de cellules eucaryotes par du ADN viral d'origine animale ou végétale, a pour objectif l'augmentation de l'efficacité du transfert du ADN dans les cellules. Le ADN viral peut s'intégrer dans le ADN cellulaire sous forme de provirus et donne à la cellule de nouveaux caractères, comme l'induction de tumeurs. La transformation de cellules eucaryotes par fusion cellulaire donnant des hybridomes (cellules hybrides), est un autre moyen de transfert de gènes d'une cellule à une autre. Après plusieurs générations, les cellules hybrides peuvent perdre certaines parties du génome (chromosomes,...) et donnent lieu à des phénotypes différents où certains gènes peuvent être localisés sur des chromosomes précis. La transformation de cellules eucaryotes par microinjection de ADN dans le noyau cellulaire permet le transfert de gènes qui s'intègrent de façon stable dans le génome de cellules maintenues en culture. 2.6. Clonage d'un gène La recombinaison in vitro d'un ADN porteur de gènes qui seront clonés dans des cellules est une des technologies de base du génie génétique. Quatre étapes principales peuvent être distinguées dans la purification d'un gène par génie génétique. Elles concernent les sources du ADN à cloner, l'insertion du ADN dans un vecteur, le clonage du ADN recombiné dans une cellule en culture et l'identification du clone cellulaire ou du virus contenant le ADN recombinant. 2.6.1. SOURCES DU ADN SUJET AU CLONAGE ADN de synthèse chimique: le principe consiste à relier des nucléotides d'enchaînement connu en fixant un trinucléotide sur un support comme le sépharose et en ajoutant d'autres trinucléotides présynthétisés. Une fois détachée de son support, la chaîne des désoxyribonucléotides servira de matrice pour synthétiser le brin de ADN complémentaire. Ainsi, des ADN double brins de plus de 50 paires de bases ont pu être synthétisés. La synthèse chimique de ADN à cloner concerne des petits fragments de ADN ('petits gènes')comme ceux des gènes des neuropeptides. ADN synthétisé à partir de ARN messager (mARN): un mARN contenant le polyA ou un mARN purifié peuvent servir de matrice pour la synthèse de ADN par une transcriptase réverse (ADN polymrase ARN dépendante) de virus. Cette synthèse nécessite une amorce (primer) comme oligo dT. Le ADN obtenu correspond à une partie du gène. Ainsi, des ADN (cADN) de 2000 paires de bases ont pu être synthétisés à partir de mARN. mARN ne contenant pas d'introns (séquences non codantes), le ADN lui correspondant par synthèse ne contient que des gènes avec uniquement leurs exons (séquences codantes). Animation, quiz: Formation du cADN ADN obtenu à partir du ADN génomique d'une cellule:Le ADN génomique d'une cellule provient d'une digestion par une ou plusieurs enzymes de restriction. Contrairement au cADN synthétisé à partir du mARN, le ADN génomique peut contenir des gènes entiers (exons + introns). La coupure du ADN par des enzymes de restriction produit des extrémités se recombinant facilement avec d'autres fragments de ADN comme ceux des ADN vecteurs. Atitre d'exemple, l'enzyme de restriction EcoRI coupe le ADN d'une cellule animale en un million de fragments de longueurs différentes (quelques dizaines à plusieurs milliers de paires de bases). Animation, quiz: clonage d'un gène (différentes étapes) INSERTION DU ADN SUJET AU CLONAGE DANS UN VECTEUR Le ADN synthétisé chimiquement ou à partir des mARN ainsi que les fragments de ADN génomique doivent être portés par un vecteur capable de se répliquer et d'être transféré dans une cellule. Pour assurer cette recombinaison in vitro, il est nécessaire d'assurer une préparation préalable du ADN à cloner et du ADN vecteur. La stratégie suivie est leurs coupures par la même enzyme de restriction. Les extrémités collantes des deux ADN se reconnaitront. Elles seront soudées par une ligase. Ainsi, des molécules hybrides (vecteur + ADN à cloner) seront reconstituées. Si cette méthode ne donne pas de résultats satisfaisants, il faudra faire appel à des modifications des extrémités des ADN. Ainsi, des queues oligo dG (20 dG) et d'oligo dC (20 dC) peuvent être ajoutées respecticement au ADN vecteur et au ADN à inserer. Par appariement des deux séquences, le ADN à cloner sera inséré dans le ADN vecteur. Une autre stratégie valable pour le ADN génomique consiste à attacher au ADN à insérer un décamère synthétique (linker) avec digestion par des enzymes de restriction correspondant au site de coupure du ADN vecteur. Animation, quiz : constitution du plasmide vecteur (étapes) CLONAGE DU ADN RECOMBINE DANS UNE CELLULE EN CULTURE Le ADN hybride recombiné et le ADN non recombiné résultant de l'étape du clonage dans un vecteur, seront introduits 1) soit dans des bactéries par transfert (plasmide) ou par infection (bactériophage), 2) soit dans une cellule eucaryote en culture par transfection ou par infection avec un virus à ADN. Le plasmide recombinant transféré dans les bactéries s'autorépliquera facilement. Les colonies bactériennes le contenant peuvent être isolées. Quant au bactériophage recombinant, il se reproduit en lysant les bactéries. On isolera des plages de lyse. Le ADN recombiné peut être cloné dans une cellule en culture. La fusion cellulaire et la précipitation des cellules avec le ADN (par utilisation du phosphate de calcium) permettent la transfection du ADN recombinant. On obtient des cellules transformées. IDENTIFICATION DU CLONE CELLULAIRE OU DU VIRUS CONTENANT LE ADN RECOMBINANT L'identification du clone cellulaire exige l'utilisation de marqueurs de sélection ou de procédés d'hybridation adaptés. Les marqueurs de sélection sont associés au vecteur ou au fragment de ADN à détecter.Ainsi, la résistance aux antibiotiques liée aux gènes portés par les plasmides bactériens est un marqueur de la présence d'un plasmide recombinant. L'hybridation du ADN recombinant avec un fragment de ADN ou de ARN comlémentaire permet d'identifier le clone désiré dans un mélange hétérogène. Le ADN des clones bactériens est hybridé in situ avec le ADN sonde marqué radioactivement. ALLER A: ADN. Expression des gènes	ADN et Génie génétique en secondaire - QCM- génie génétique. - QCM-clonage - QCM-Réplication - QCM-transcription - QCM- réplication-transcription - QCM-Traduction - ADN Réplication - Transcription ADN-ARN - Structure d'un gène - Manipulation du ADN et bases du génie génétique - Protéines recombinantes
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Gène - génie génétique

Le génie génétique qui conduit aux transformations génétiques s'opérant sur l'ADN, s'appuie sur un ensemble d'outils cellulaires et moléculaires dont le clonage d'un gène.