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Les protéines et les enzymes (étude = enzymologie) sont des macromolécules constituées
d'acides aminés.
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- Contrôle 2011
- Contôle 2010
- Contôle 2009
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Enoncé 1
Le peptide Ala-Glu-Glu-Met-Glu -Ile (AEEMEI) est mis en solution aqueuse
à la concentration de 10-2 M.
- Quel est le pH de la solution obtenue ?
- Calculez le pH du point isoélectrique (pHi)
- Donnez le pourcentage des différentes formes à un pH de
8.
On donne :Ile alpha-COOH : pK = 2,6 ;Glu R-COOH : pK = 4,3 ; Ala alpha-NH3+
: pK = 9,8
Enoncé 2
Un mélange de trois peptides est soumis à une électrophorèse
sur papier à un pH de 6,5.
- Indiquez la position des 3 peptides à la fin de l'expérience.
- Déterminez un pH pour optimiser cette séparation.
Les trois peptides sont :1 : His-Gly-Pro-Lys ; 2 : Glu-Leu-Cys-Asp ;
3 : Ala-Gly-Ile-Ser
On donne :
His alpha-NH3+ : pK = 9,2 ; HisR-amine : pK = 6; Lys -COOH ? : pK =
2,2; LysR-amine pK=10,5
Glu alpha-NH3+ : pK= 9,7 ; GluR-COOH: pK = 4,3; Asp -COOH ? : pK=2,1;
Asp R-COOH pK = 3,9; Ala?-NH3+ :pK = 9,8 ; Ser -COOH ? : pK = 2,2
Enoncé 3
- Quelle est la méthode de séquençage la plus utilisée pour les peptides ?Enoncé 4
- L'étude d'un pentapeptide donne les résultats suivants:Enoncé 5
Une protéine étudiée par gel filtration dans un tampon aqueux à pH7 présente un poids moléculaire de 160.000 daltons. Si cette protéine est soumise à une électrophorèse sur gel en présence de SDS (Sodium Dodécyl Sulfate), la révélation montre 2 bandes correspondant à des poids moléculaires de 50000 et 30000.Enoncé 6
Un peptide X dont la composition globale en acide aminé est la suivante : 2 Arg, 2 Asp,1 Gly, 2 Met, 1 Phe, est soumis à différents traitements suivis d'une analyse séparative des produits :Enoncé 7
La lactate déshydrogénase du muscle catalyse la réaction suivante :Lambda (nm) | D.O (NAD+) | D.O (NADH) |
220 | 0,150 | 0,160 |
260 | 0,840 | 0,850 |
300 | 0,160 | 0,150 |
340 | 0,00 | 0,860 |
380 | 0,00 | 0,140 |
-
Proposer une méthode de suivi de la réaction enzymatique
de transformation du pyruvate en lactate?
- Cette enzyme a été purifiée selon les étapes
suivantes :
Etapes |
Activité
enzymatique (U.I.E.) |
Quantité des protéines (mg) |
Extrait brut | 20000 | 1000 |
Précipité au sulfate d'ammonium | 14000 | 200 |
Chromato. échangeuse d'ions |
4500 | 15 |
Chromato. d'affinité | 1600 | 1 |
-
Quel est le rendement global de cette opération de purification
? (détailler calcul)
- Donnez le taux de purification atteint. ( détailler calcul).
1)
Les 4 acides aminés suivants ont leurs pK de la fonction alpha
COOH d'une valeur de 2,0 et les pK de leur fonction alpha NH2 d'une valeur de
9,5. Par contre, ils diffèrent par les pK donnés ci-dessous de
leur radical R ionisable :
Acide aminé A (pK=10,54) -- Acide aminé B (pK=10,46)
-- Acide aminé C (pK=4,07) -- Acide aminé D (pK=6,04)
a) Classez ces acides amines selon leur catégorie : apolaire; polaire non chargé et polaire chargé
b) Nommez chacun de ces 4 acides aminés
c) Donnez le pHi de chacun de ces 4 acides aminés
2) La lactate déshydrogénase
est une protéine à fonction enzymatique. Elle a été
extraite et purifiée à partir de germes d'orge en fermentation.
Le dosage de l'activité de cette enzyme et le dosage des protéines
totales ont été effectués aux différentes étapes
du fractionnement et de la purification depuis l'extrait brut jusqu'à
l'étape finale où l'enzyme est assez pure. Les résultats de ces deux types de dosage sont donnés sur le tableau suivant :
Fractions | Teneur en Protéines totales (mg) |
Activité Enzymatique de la LDH (µKatal) |
Extrait brut | 50000 | 10000 |
Précipité au sel (NH4)2SO4 |
5000 | 3750 |
Eluat d'échangeur d'ion | 500 | 500 |
Eluat de tamis moléculaire | 25 | 250 |
Eluat de chromato. d'affinité | 1 | 100 |
a)
Donnez la signification de microKatal
b) Donnez le nom et le principe d'une méthode permettant
de déterminer la teneur en protéines totales
c) Donnez les valeurs des activités spécifiques de
la lactate déshydrogénase pour chaque fraction et le nombre
de fois que cette enzyme a été purifiée après
chaque fractionnement.
d) Sachant que cette enzyme est constituée de 4 sous unités
et que sa masse moléculaire est de 140 000. Calculer l'activité
moléculaire spécifique en moles de substrat hydrolysé
par mole d'enzyme et par minute. Donnez les différents types de
liaisons chimiques qui existent entre les sous unités (ou monomères)
d'une protéine.
3)
Après avoir obtenu cette lactate déshydrogénase (LDH) pure,
on a isolé par hydrolyse trypsique un peptide P comprenant la Cystéine
( Cys) du site actif. L'hydrolyse acide totale suivie de l'hydrolyse alcaline
totale ont donné la présence des 12 acides aminés
suivants : 1 Cys ; 2 Arg ; 1 Ala ; 1 Val ; 1 Leu ; 1 Ile ; 2 Ser ; 1 Asp
; 1Arg ; 1 Asn. L'action du dinitrofluorobenzène ( DNFB ) montre
que la Val est en extrémité
N-terminal de P. Après hydrolyse acide ménagée de
P, on a isolé 3 peptides : X, Y et Z.
X comprend : Arg, Ala et Ser. La réaction de Dansylation sur X
donne Dansyl-Ser.
Y comprend : Gly, Ile et Val. La carboxypeptidase libère Gly de
Y.
Z comprend 6 acides aminés. Le réactif d'Edman sur Z libère
successivement Ser et Gly. Une carboxypeptidase libère après
action prolongée sur Z successivement : Asp, Leu et Asn.
a) Donner la séquence en acides aminés du peptide
P. Positionnez au niveau de cette séquence les fragments X, Y et
Z.
b) Quel est l'acide aminé qui reliait avant coupure, le
peptide P à la lactate déshydrogénase.
1/ Acides aminés
- Donner selon votre choix, le nom complet et en abrégé ainsi
que la formule développée d'un acide aminé à
pHi acide faisant partie de la structure des protéines.
2/ Techniques d'analyse
Pour pouvoir séparer un mélange d'acides aminés basiques
en solution dans un tampon à pH 7,0 par chromatographie échangeuse
d'ions, quelle matrice allez-vous choisir ?, cationique ou anionique ?
Justifiez votre réponse.
Calculer le pHi de l'hexapeptide: Asp-Lys-Ala-Ser-Cys-Gly selon les données
suivantes:
pKa Asp = 2,4, pKr Asp = 4,5, pKr Lys = 9,5, pK N-terminal = 8,5, pKa Gly = 2,5, pK C-terminal = 2,1.
Justifiez votre réponse
4/ Séquençage des prptéines
Proposez un protocole expérimental permettant d'aboutir à la séquence
primaire du peptide suivant, tout en justifiant vos hypothèses.
(NH2)t-Ala-Val-Met-Ser-Gly-Lys-Leu-Cys-Trp-Glu-(COOH)t
5/Après extraction et homogénéisation dans un tampon
à pH 7,0 des protéines totales de la tomate, l'extrait brut
obtenu, a été soumis à un fractionnement isoélectrique (pHi). Donnez la nature chimique acide ou base des protéines qui
vont se retrouver dans le culot et la nature de celles qui vont se retrouver
dans le surnageant. Justifier votre réponse.
6/ Un mélange de 5 protéines A, B, C, D et E a été
déposé puis élué à travers une colonne
de chromatographie d"exclusion (tamis moléculaire). Quel serait
l'ordre d'élution de ces protéines, sachant que la limite
d'exclusion de la phase stationnaire (gel dextran pu Sephadex) est de
75000 et que les poids moléculaires (PM) des 5 protéines
sont comme suivant:
A = 120000, B = 180000, C = 55000, D= 42000 et E = 35000
7/Quelles sont les différentes liaisons chimiques dans chacune
des conformations protéiques suivantes:
- Structure primaire
- Structure secondaire en hélice
- Structure secondaire en feuillet plissé
- Structure tertiaire
- Structure quaternaire
1/L'énergie libre est exprimée selon
Gibbs par l'équation suivante:
/\G = /\H - T /\S.
- Donnez en justifiant votre réponse, les signes des différentes
composantes thermodinamiques (enthalpie, entropie, énergie libre,
..) dans le système biochimique de la combinaison de l'hydrogène
gaz avec l'oxygène gaz pour former de l'eau selon la réaction
suivante:
2 H2 + O2 ----> 2 H2O
- Dites si le système dégage ou absorbe de la chaleur ?
2/ Donnez le pourcentage de la forme protonée (+) de l'acide aminé
Histidine (His) à pH 7,2. Le pK de His est 6,04.
3/ On vous propose de séparer deux protéines solubles par
précipitation sélective. Quelle technique allez vous proposer,
autre que le 'salting out'? Donner son principe
4/L'histone du boeuf est une protéine basique. Quelle type de chromatographie
échangeuse d'ions allez-vous proposer pour la purifier? Cationique
ou anionique? Expliquez les différentes étapes de cette
technique.
5/ Citez les 3 méthodes usuellement utilisées pour déterminer
le poids moléculaire d'un polypeptide ou d'une protéine?
Donnez le principe de chacune d'elles.
6/ Utilisant la technique d'électrophorèse sur gel de polyacrylamide
dans les conditions dénaturantes (SDS PAGE), le poids moléculaire
obtenu pour une protéine est de 6800. Cependant, après
traitement de cette protéine par le béta mercaptoéthanol,
cette électrophorèse a révélé deux
bandes de poids moléculaire 2300 et 4500.
- La réaction d'Edman est elle suffisante pour séquencer
cette protéine? Justifier votre réponse.
- Enumérez les premières étapes techniques qui vont
vous permettre de déterminer la séquence primaire de cette
protéine.
- Quelles sont les liaisons chimiques impliquées dans la structure
quaternaire d'une protéine oligomérique?
7/ Indiquez si les peptides ci dessous (a-e) sont coupés par les
traitements indiqués et donner les produits obtenus après
chaque coupure:
a- Phe-Arg-Glu ----- trypsine
b- Phe-Met-Leu ----- carboxypeptidase B
c- Ala-Met-Phe ------ Chymotrypsine
d- Gly-Met-Lys ------ CnBr
e- Pro-Arg-Met ------ Trypsine
8/ Un mélange d'histidine, de valine et d'acide aspartique a
été soumis à une électrophorèse sur
papier à pH 5,2.
- Donnez la position relative de ces trois acides aminés sur une
bande de papier après électrophorèse.
On donne les points isoélectriques de ces trois acides aminés:
His (7,65), Val (6,0) et Asp (2,95).
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