Protéines, enzymes. Contrôle S3

Les protéines et les enzymes (étude = enzymologie) sont des macromolécules constituées d'acides aminés.

Contrôle 2 du module 'Biochimie structurale, partie acides aminés, protéines, enzymologie , 2012, Filère 'sciences de la vie', Faculté des Sciences, Université Cadi Ayyad, Marrakech, Maroc, durée 1 heure et 30 minutes) Correction détaillée dans le livre 'Sciences de la vie. Protéines et Enzymes' avec DVD, Baaziz, 2013

Avertissement: Une fois les examens et contrôles sont organisés par l'Institution d'origine, celle ci détient possession des archives qui deviennent disponibles sur les supports d'information (dont site web) de l'Institution et sont ainsi rendues accessibles pour aider les étudiants des années suivantes à préparer leurs contrôles et examens. Tout usage dans cette optique reste légal et n'enfreigne pas la loi.

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Enoncé 1
Le peptide Ala-Glu-Glu-Met-Glu -Ile (AEEMEI) est mis en solution aqueuse à la
concentration de 10-2 M.
- Quel est le pH de la solution obtenue ?
- Calculez le pH du point isoélectrique (pHi)
- Donnez le pourcentage des différentes formes à un pH de 8.
On donne :Ile alpha-COOH : pK = 2,6 ;Glu R-COOH : pK = 4,3 ; Ala alpha-NH3+ : pK = 9,8

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Enoncé 2
Un mélange de trois peptides est soumis à une électrophorèse sur papier à un pH de 6,5.
- Indiquez la position des 3 peptides à la fin de l'expérience.
- Déterminez un pH pour optimiser cette séparation.
Les trois peptides sont :1 : His-Gly-Pro-Lys ; 2 : Glu-Leu-Cys-Asp ; 3 : Ala-Gly-Ile-Ser
On donne :
His alpha-NH3+ : pK = 9,2 ; HisR-amine : pK = 6; Lys -COOH ? : pK = 2,2; LysR-amine pK=10,5
Glu alpha-NH3+ : pK= 9,7 ; GluR-COOH: pK = 4,3; Asp -COOH ? : pK=2,1;
Asp R-COOH pK = 3,9; Ala?-NH3+ :pK = 9,8 ; Ser -COOH ? : pK = 2,2

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Enoncé 3
- Quelle est la méthode de séquençage la plus utilisée pour les peptides ?

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Enoncé 4
L'étude d'un pentapeptide donne les résultats suivants :
- Une hydrolyse acide (HCl 6N, 110° C, 72h) donne la composition suivante :
Ala, Arg, Cys, Lys, Ser
- L'action de la trypsine donne un tripeptide et un dipeptide
- L'action du DNFB (méthode de Sanger) sur le tripeptide donne le DNP-Ser
Parmi les séquences primaires suivantes, laquelle ou lesquelles sont compatibles avec les séquences ci-dessous :
a) Lys-Ala-Arg-Cys-Ser
b) Ala-Arg-Cys-Ser-Lys
c) Ala-Arg-Cys-Lys-Ser
d) Ser-Ala-Arg-Cys-Lys
e) Ser-Lys-Ala-Arg-Cys
f) Ser-Arg-Ala-Cys-Lys

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Enoncé 5
Une protéine étudiée par gel filtration dans un tampon aqueux à pH7 présente un poids moléculaire de 160.000 daltons. Si cette protéine est soumise à une électrophorèse sur gel en présence de SDS (Sodium Dodécyl Sulfate), la révélation montre 2 bandes correspondant à des poids moléculaires de 50000 et 30000.
- Expliquer ces résultats.

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Enoncé 6
Un peptide X dont la composition globale en acide aminé est la suivante : 2 Arg, 2 Asp,1 Gly, 2 Met, 1 Phe, est soumis à différents traitements suivis d'une analyse séparative des produits :
1/ Traitement par du bromure de cyanogène CNBr (qui coupe après le segment carboxyle du résidu amino-acide de la Méthionine), suivi d'une séparation des fragments obtenus par chromatographie en couche mince : on observe la présence de 2 taches correspondant à 1 dipeptide et à 1 tripeptide.
2/ Traitement par la trypsine suivi d'une chromatographie : on observe 1 dipeptide et 2 tripeptides
3/ Traitement par la chymotrypsine (qui coupe les liaisons peptidiques sur le versant carboxylique des AA aromatiques) suivie d'une chromatographie : on observe 1acide aminé et 1 peptide.

- Quelle est la séquence des acides aminés du peptide X ?

- Proposer une méthode de suivi de la réaction enzymatique de transformation du pyruvate en lactate?
- Cette enzyme a été purifiée selon les étapes suivantes :

- Quel est le rendement global de cette opération de purification ? (détailler calcul)
- Donnez le taux de purification atteint. ( détailler calcul).

Acide aminé A (pK=10,54) -- Acide aminé B (pK=10,46) -- Acide aminé C (pK=4,07) -- Acide aminé D (pK=6,04)

a) Classez ces acides amines selon leur catégorie : apolaire; polaire non chargé et polaire chargé
b) Nommez chacun de ces 4 acides aminés
c) Donnez le pHi de chacun de ces 4 acides aminés

2) La lactate déshydrogénase est une protéine à fonction enzymatique. Elle a été extraite et purifiée à partir de germes d'orge en fermentation. Le dosage de l'activité de cette enzyme et le dosage des protéines totales ont été effectués aux différentes étapes du fractionnement et de la purification depuis l'extrait brut jusqu'à l'étape finale où l'enzyme est assez pure. Les résultats de ces deux types de dosage sont donnés sur le tableau suivant :

a) Donnez la signification de microKatal
b) Donnez le nom et le principe d'une méthode permettant de déterminer la teneur en protéines totales
c) Donnez les valeurs des activités spécifiques de la lactate déshydrogénase pour chaque fraction et le nombre de fois que cette enzyme a été purifiée après chaque fractionnement.
d) Sachant que cette enzyme est constituée de 4 sous unités et que sa masse moléculaire est de 140 000. Calculer l'activité moléculaire spécifique en moles de substrat hydrolysé par mole d'enzyme et par minute. Donnez les différents types de liaisons chimiques qui existent entre les sous unités (ou monomères) d'une protéine.

3) Après avoir obtenu cette lactate déshydrogénase pure, on a isolé par hydrolyse trypsique un peptide P comprenant la Cystéine ( Cys) du site actif. L'hydrolyse acide totale suivie de l'hydrolyse alcaline totale ont donné la présence des 12 acides aminés suivants : 1 Cys ; 2 Arg ; 1 Ala ; 1 Val ; 1 Leu ; 1 Ile ; 2 Ser ; 1 Asp ; 1Arg ; 1 Asn. L'action du dinitrofluorobenzène ( DNFB ) montre que la Val est en extrémité
N-terminal de P. Après hydrolyse acide ménagée de P, on a isolé 3 peptides : X, Y et Z.
X comprend : Arg, Ala et Ser. La réaction de Dansylation sur X donne Dansyl-Ser.
Y comprend : Gly, Ile et Val. La carboxypeptidase libère Gly de Y.
Z comprend 6 acides aminés. Le réactif d'Edman sur Z libère successivement Ser et Gly. Une carboxypeptidase libère après action prolongée sur Z successivement : Asp, Leu et Asn.
a) Donner la séquence en acides aminés du peptide P. Positionnez au niveau de cette séquence les fragments X, Y et Z.
b) Quel est l'acide aminé qui reliait avant coupure, le peptide P à la lactate déshydrogénase.

- Donner la formule générale d'un acide aminé constitutif de la structure primaire d'une protéine

- Donner selon votre choix, le nom complet et en abrégé ainsi que la formule développée d'un acide aminé à pHi acide faisant partie de la structure des protéines.

2/ Techniques d'analyse

Pour pouvoir séparer un mélange d'acides aminés basiques en solution dans un tampon à pH 7,0 par chromatographie échangeuse d'ions, quelle matrice allez-vous choisir ?, cationique ou anionique ? Justifiez votre réponse.

3/ Ionisation des acides aminés

Calculer le pHi de l'hexapeptide: Asp-Lys-Ala-Ser-Cys-Gly selon les données suivantes:

pKa Asp = 2,4, pKr Asp = 4,5, pKr Lys = 9,5, pK N-terminal = 8,5, pKa Gly = 2,5, pK C-terminal = 2,1.

Justifiez votre réponse

4/ Séquençage des prptéines

Proposez un protocole expérimental permettant d'aboutir à la séquence primaire du peptide suivant, tout en justifiant vos hypothèses.

(NH2)t-Ala-Val-Met-Ser-Gly-Lys-Leu-Cys-Trp-Glu-(COOH)t

5/ Après extraction et homogénéisation dans un tampon à pH 7,0 des protéines totales de la tomate, l'extrait brut obtenu, a été soumis à un fractionnement isoélectrique (pHi). Donnez la nature chimique acide ou base des protéines qui vont se retrouver dans le culot et la nature de celles qui vont se retrouver dans le surnageant. Justifier votre réponse.

6/ Un mélange de 5 protéines A, B, C, D et E a été déposé puis élué à travers une colonne de chromatographie d"exclusion (tamis moléculaire). Quel serait l'ordre d'élution de ces protéines, sachant que la limite d'exclusion de la phase stationnaire (gel dextran pu Sephadex) est de 75000 et que les poids moléculaires (PM) des 5 protéines sont comme suivant:

A = 120000, B = 180000, C = 55000, D= 42000 et E = 35000

7/ Quelles sont les différentes liaisons chimiques dans chacune des conformations protéiques suivantes:

- Structure primaire
- Structure secondaire en hélice
- Structure secondaire en feuillet plissé
- Structure tertiaire
- Structure quaternaire