PEROXYDASE (TP). STRUCTURE

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-Le Fe III tend à établir avec son environnement immédiat 6 liaisons de coordinence avec des atomes donneurs d'électrons. Si les atomes donneurs sont à "champ fort" (ex: N), ils imposent une répartition des électrons périphériques du fer qui le rend stable. C'est le fer " bas-spin " peu réactif. Si les donneurs sont à champ plus faible (ex: O de l'eau), la répartition des électrons périphériques échappe à toute contrainte de leur part, le fer est dans un état électronique instable qui le rend très réactif: c'est le fer" haut-spin". Le fer peut également être pentacoordiné. Des techniques physiques permettent de repérer les "états" du fer.

-Ici, le Fe III établit des liaisons avec les 4 atomes d'azote de la porphyrine et avec un azote de His 170 (His proximal) situé à proximité. Une autre, His 42 (His distal) située à l'opposé, est trop éloigné pour établir la sixième coordinence. Une molécule d'eau se trouve dans la zone (polaire) de la sixième coordinence. Dans la peroxydase, le fer est dans un état "haut-spin". Les étudiants peuvent restreindre l'environnement de l'hémine à His 42, Arg 38, His 170 et éventuellement H2O 999 (HOH999).

Quelques données concernant le mécanisme réactionnel

Des techniques physiques ont permis d'analyser le mécanisme complexe de la catalyse qui ne sera pas exposé ici. On peut simplement retenir que c'est d'abord H2O2 qui est attiré dans la zone polaire de la crevasse, au voisinage de His 42, Arg 38 et du Fer III. L'arrivée d'une molécule de peroxyde déplaçant la molécule d'eau distale. Une fois dans le site actif, H2O2 interagit avec des résidus d'acides aminés et l'hémine ce qui conduit à la formation d'eau d'une part et à celle d'un composé avec fer bas-spin, la sixième coordinence étant alors" bien occupée". H2O2 est réduit en eau.
Ensuite, c'est le 2ème substrat (gaïacol par exemple) qui intervient. L'oxydation de 2 molécules de ce substrat est nécessaire pour que l'enzyme et son groupement héminique reviennent à l'état initial. Cela libère une deuxième molécule d'eau.
Le cycle catalytique fait intervenir des transferts de H+ et d'e- .

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Site actif et acides aminés impliqués dans la catalyse

- L'exploitation avec RasMol du fichier 2atj permet de reconstituer un complexe peroxydase-acide benzhydrozamique. Le faux-substrat est en place dans la poche du site actif dans un environnement surtout hydrophobe, mais à proximité de His 42, Arg 38 et de l'hémine (zone hydrophile).
-Les acides aminés His 42, Arg 38 et His 170, sont conservés dans les différentes peroxydases.
-Le remplacement de certains acides aminés par mutagénèse dirigée (préparation d'un gène synthétique modifié puis exprimé dans E. Coli) complété par des études cristallographiques et/ou cinétiques fournit des renseignements sur le rôle des différents ac.aminés.

Effets sur l'affinité de la peroxydase pour H2O2.

Le remplacement de His 42 diminue toujours l'affinité de l'enzyme pour H2O2 et ralentit la réaction. Le remplacement de Arg 38 (polaire) par Leu 38 (apolaire) diminue également l'affinité de l'enzyme pour H2O2 et surtout pour le 2ème substrat. Ces résidus d'acides aminés semblent directement impliqués non seulement dans la formation des complexes avec les 2 substrats mais aussi dans la réaction proprement dite.

Effets sur la Vitesse maximale (Vmax) de la peroxydase.

Le remplacement de Asn 70 par Val 70 entraîne une baisse de Vmax de plus de 90%. Nagano et al. expliquent cela en considérant qu'entre Asn 70 et His 42 il peut y avoir une liaison hydrogène qui ne peut s'établir entre Asn 70 et His 42. Cette perte diminuerait la réactivité de His 42 et changerait sa position dans l'espace. Le modèle (2atj) en 3D ne montre pas cette liaison entre Asn et His.. On peut visualiser Asn70

Environnement du site actif

- Environnement surtout hydrophobe de l'hémine
L'hémine se trouve dans une poche limitée par des résidus d'acides aminés surtout hydrophobes (zone apolaire), les seuls groupements polaires à proximité appartiennent à His 42, Arg 38 et His 170.

- Poche avec deux régions; l'une hydrophobe, l'autre hydrophile.
Le substrat est logé dans une poche dans laquelle il oriente son cycle apolaire vers la partie hydrophobe constituée par les Ac. aminés Phe179, Pro141, Ala140, Pro139, Phe 68, Gly 69 (+ une portion de l'hème). Il oriente ses parties polaires vers His 42 et Arg 38, à proximité du fer.

1) set backgroung white (passer à la couleur blanche)
2) select ligand (selection de l'heme, du faux substrat et des atomes de Ca)
3) color red (+ display spacefill)
4) restrict :a (pour étudier une seule chaîne, respecter espace après restrict !)

A l'aide du curseur noter le Numéro de l'atome du fer (ici 4779).

5) select atomno=4779 (atome Fe de l'heme),
rappel: pour connaître les coordonnées d'un atome, pointer dessus et lire les coordonnées dans la fenêtre des commandes)
6) color blue
7) select his42:a (histidine distale de la chaîne a), (+ display ball & stick)
8) color orange
9) select his170:a (histidine proximale de la chaîne a), (+ display ball & stick),
Exporter GIF ou le script ..pox1 pour toute sauvegarde (file -> export -> script et enregister dans le répertoire où réside l'application rastop. Le même résultat peut être obtenu en saisissant la commande: write script pox1script. Le script peut être ouvert par file -> open -> script -> ou par la commande 'script pox1script' dans la fenêtre des commandes)

Peroxydase. structure du complexe enzyme substrat

Visualisation du calcium

10) select ca351 (atome de calcium)
11) color green
12) select ca352 (atome de calcium)
13) color green

Visualisation de l'arginine 38

14) select arg38:a
15) color cyan (+ display ball & stick)
16) select BHO353:a (faux substrat = acide benzhydrozamique)
17) color magenta (+ display ball & stick)
18) set picking label (permet d'activer l'annotation, sorte de 'stylo' lorsque vous pointez)
19) set picking ident (permet d'inactiver l'annotation)

Visualisation de la molécule d'eau entre His distale et Fe

20) select HOH999 (selection de la molécule d'eau 999)
21) color black (+ display ball & stick), (export GIF ..pox2)
22) write script pox1script (ceci permet d'appeler ce script si vous perder l'image)

Rappels:
- Pour sélectionner toutes les Phe, saisissez dans la fenêtre des commandes 'select Phe'
- Pour sélectionner toutes les Phe de la chaîne a, saisissez dans la fenêtre des commandes 'select Phe:a'
- Pour sélectionner toutes les molécule d'eau, saisissez dans la fenêtre des commandes 'select HOH'

23) select HOH:a (sélectionner toutes les molécule d'eau de la chaîne a)
24) color black (+ display ball & stick), (export GIF ..pox3)

Questions à y répondre via le programme Rastop

Peroxydase de navet (complexe avec l'acide benzhydroxamique)

1/ Structure primaire :
- Nombre d'acides aminés :
<Show sequence> : 307 acides aminé par chaîne x 2 chaînes
- Acides aminés N-terminal et C-terminal : N-terminal (Gln1), C-terminal (Asn307)

2/ Structure secondaire :
- Nombre de pont S-S : <ssbonds> : 8 (= 4 x 2), ou <select cys>
- Hélices alpha : ribbons : display

3/ Positionnement de l'hème et Calcium et des acides aminés du site actif (His42 (histidine distale), Arg38 et His170 (histidine proximale)

- <select ligand>, spacefill : heme, 2 Ca et BHO353 (acide benzhydroxamique)
- <select hetero> spacefill : heme, 2 Ca, BHO353 et molecules d'eau
- mesurer distances entre His42 et Fe (Fe4779)

4/ Pourquoi BHO vient il se fixer dans la poche catalytique ?

- chaîne A en spacefill
- restrict within(10.0,BHO353)
- select bho353 + color yellow + Sticks
- write script pox_bho

5/ Comment il est orienté le BHO dans la poche catalytique ?
Le substrat est logé dans une poche où il oriente son cycle apolaire hdrophobe vers la partie hydrophobe du site constituée par les acides aminés Phe179, Pro141, Ala140, Pro139, Phe68, Gly69 ( + une partie de l'hème). D'autre part, le substrat oriente sa partie polaire vers His42 et Arg38, à proximité du fer.

Concernant les structures enzymatiques des peroxydases des plantes telle que la peroxydase du raifort, donner en s'aidant du programme RasTop une meilleure représentation graphique illustrant l'existence d'une molécule d'eau entre l'histidine distale (His42) de la zone polaire et le fer de l'hème.

Question 2. Concernant les structures enzymatiques des peroxydases des plantes telle que la peroxydase du raifort, donner en s'aidant du programme RasTop une meilleure représentation graphique illustrant la nature hydrphobe de la zone apolaire de l'environnement de l'hème.

Question 3. Concernant les structures enzymatiques des peroxydases des plantes telle que la peroxydase du raifort, donner en s'aidant du programme RasTop une meilleure représentation graphique illustrant le point d'attachement de l'hème à l'apoprotéine de l'enzyme.

Question 4.Concernant les structures enzymatiques des peroxydases des plantes telle que la peroxydase du raifort, donner en s'aidant du programme RasTop une meilleure représentation graphique illustrant l'état hexacoordonné de l'atome de fer de l'hème.

Sauver le travail sous forme d'un fichier script portant un nom indiquant le groupe de TP et les noms des deux étudiants ayant participé au travail (exemple 3-hilal-hanafi à placer dans le répertoire

LIENS UTILES

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  - -Peroxydases du cactus (Opuuntia ficus indica L.)
  - Peroxydases du figuier de barbarie
  - Peroxydases de céréales
  - - Peroxydases des palmiersdattiers mâles et femelles
  - Peroxydases des plantes. Théorie et pratique (Conférence de Baaziz, 2006)
  - Etude cinétique de la peroxydase du palmier dattier et détermination du mécanisme de catalyse