Les peroxydases sont des enzymes qui catalyse l'oxydation de molécules donneurs de protons H+ (comme les composés phénoliques des plantes) en présence du peroxyde d'hydrogène (eau oxygénée, H2O2) qui sera réduit en molécules d'eau (H2O2).

2. Matériel végétal.

Les graines de 2 céréales cultivées au Maroc, le blé tendre et l'orge, sont imbibées d'eau, disposées entre 2 papiers filtres et mises en germination dans des bacs en plastique remplis de vermiculite. Les jeunes plants obtenus sont irrigués par l'eau du robinet chaque période de 3 jours. Ils sont utilisés après 8 jours de culture.

3. Extraction et dosage des peroxydases

Prélever 5 g de tiges (partie entre la feuille et les racines) à partir des jeunes plants de blé ou d'orge (selon les groupes). Après rinçage avec l'eau distillée, broyer le matériel végétal dans un mortier maintenu dans la glace, en présence de 30 ml de tampon d'extraction :

- Acétate-acide acétique (pH 5,0) .....................10 mM
- MgCl2 ……………….........................................2 mM
- 2 mercaptoéthanol ………………….................2 mM
- PVPP ………………………............................ 5% (P/P)

Le 2 mercaptoéthanol empêche partiellement l'oxydation des phénols en quinones qui peuvent provoquer l'inactivation des enzymes.
Le PVPP, utilisé en milieu acide, adsorbe les composés phénoliques susceptibles d'entraîner l'inactivation des peroxydases.
L'homogénat obtenu est transvasé dans un tube de centrifugation (pour rotor Sorvall SS34) puis centrifugé 10 min à 10000 g. Après centrifugation, le surnageant (extrait brut) est récupéré dans une éprouvette de 100 ml. On note son volume final et on en prélève un volume de 1,5 ml qui servira dans les analyses suivantes.

Fractionnement par le sulfate d'ammonium.

Les protéines de l'extrait brut sont précipitées progressivement à froid, par le sulfate d'ammonium jusqu'à l'obtention d'un taux de saturation de 80% (51,6 g/100 ml). Après 2 heures et 30 min de précipitation à 0°C-4°C (glace) sous agitation lente, l'extrait est centrifugé à 10000 g pendant 10 min. Le culot obtenu est repris dans un faible volume (2 ml) de tampon acétate-acide acétique 10 mM (pH 5,0).

Chromatographie d'exclusion sur Sephadex G100.

L'extrait protéique obtenu par précipitation à 80% de saturation en sulfate d'ammonium, est filtré sur une colonne (1 cm x 15 cm) remplie de Sephadex G100. Après dépôt de l'extrait, 12 fractions de 1,5 ml sont collectées en bas de la colonne (chromatographie d'exclusion basée su le critère de la taille des molécules). Le dosage de l'activité enzymatique sera effectué sur l'ensemble des fractions. Il permet de tracer le profil d'élution des peroxydases des céréales. Les 2 fractions les plus actives du/des pic(s) seront rassemblées, séparément et conservées pour l'évaluation de la purification (rendements, taux de purification,…).

Dosage de l'activité enzymatique des peroxydases.

L'activité enzymatique est déterminée par spectrophotométrie (voir vidéo spectrophotometrie dans takween supports) en utilisant le gaiacol et le peroxyde d'hydrogène (H2O2) comme substrats de l'enzyme.
Dans une cuve de 1 ml, déposer, dans l'ordre, 0,5 ml de tampon acétate 0,1 M (pH 5,0), 0,4 ml de gaiacol (à une concentration précisée selon le test, voir tableau ci dessous), 0,050 ml d'enzyme et 0,050 ml de H2O2 (à une concentration précisée selon le test) qui servira pour déclencher la réaction. Le réglage à zéro de la densité optique (DO) est réalisé après ajout de l'enzyme. Après déclenchement de la réaction par addition de H2O2 (concentration déterminée), la cuve, fermée à l'aide d'un papier aluminium, est agitée rapidement (par inversion dans les deux sens), puis introduite dans le spectrophotomètre, préalablement réglé sur une longueur d'onde égale à 470 nm. De suite, le temps de la réaction est suivi à l'aide d'un chronomètre. Lire la DOà 470 nm au bout de chaque minute pendant une durée de 3 minutes. Noter la variation de DO entre la la 3ième et la 2ème et minute et entre la 2ième et la 1ière minute. Une unité enzymatique correspond à la quantité de protéines donnant 0,1 unité de DO à 470 nm.

4. Détermination du mécanisme de catalyse des peroxydases

A partir de 4 concentrations de gaiacol et 4 concentrations de H2O2, faire les cinétiques pour chaque couple de concentration représenté dans le tableau ci-dessous et calculer les variations de DO correspondantes :

* H2O2 1% correspond à 293 mM.

5. Séparation des isoenzymes des peroxydases par électrophorèse non dénaturante sur gel de polyacrylamide

L'électrophorèse est faite verticalement sur des gels en polyacrylamide (voir vidéo de l'éléctrophorèse non dénaturante des isoenzymes, cas du palmier dattier).

Préparation des gels de polyacrylamide.

Les gels de polyacrylamides ont une épaisseur de 1 mm et sont confectionnés à l'aide de 2 plaques de verre de dimension 18 X 14 cm. La partie supérieure du gel, lieu du dépôt des extraits enzymatiques, présente une texture à porosité large (gel de concentration, 5% en polyacrylamide). Ce gel permet de concentrer les extraits avant leur séparation sur le gel à porosité étroite (gel de séparation, 10% en polyacrylamide). La composition des 2 gels est résumée dans le tableau suivant :

Electrophorèse.

Des volumes de 50 µl des différents extraits, préalablement mélangés avec 20 µl d'une solution de bleu de bromophénol, sont déposés dans les puits du gel de concentration. L'électrophorèse est faite à 35 mA. Le tampon d'électrodes (pH 8,3) est constitué de Tris 0,025 M, Glycine 0,192 M. Elle dure 5heures, environ (elle est arrêtée lorsque le bleu de bromophénol est à 0,5 cm de l'extrémité inférieure du gel).

Révélation des isoperoxydases.

Du gaiacol 0,023 M est préparé dans un tampon acétate 0,1 M (pH 5,0). Le gel ayant servi de support d'électrophorèse est trempé dans cette solution pendant 5 min. La révélation des peroxydases est ensuite déclenchée par addition de 1 ml de H2O2 1%. Laisser réagir 10 min à 40°C puis rincer le gel avec l'eau.

6. Résultats et discussion

Purification des peroxydases et détermination du mécanisme de catalyse.

* Tracer le profil d'élution des peroxydases.
* Déterminer les activités peroxydasiques de l'extrait brut et des fractions
enzymatiques obtenues par assemblage des contenus des tubes (pic(s) d'activité) après chromatographie sur Sephadex
G100. Calculer les rendements de purification pour chaque étape.
* Calculer les concentrations finales (en mM) du peroxyde d'hydrogène et du gaiacol utilisées dans la détermination du mécanisme de catalyse des peroxydases.
* Pour chaque fraction enzymatique obtenue après filtration sur Sephadex G100, donner les tableaux (à double entrées) des activités (en variation de DO à 470 nm) déterminées en présence des différentes concentrations (en mM) de gaiacol et de peroxyde d'hydrogène.
* Tracer les diagrammes primaires 1/v = f(1/[S]) pour chacun des 2 substrats. En déduire les diagrammes secondaires.
* Proposer le(s) mécanisme(s) susceptible(s) de rendre compte des cinétiques obtenues.
* Calculer les valeurs des paramètres cinétiques Km et Vmax. Les comparer à celles trouvées par le Logiciel Leonora.
* Donner le schéma de Cleland correspondant au mécanisme de catalyse des peroxydases des céréales.

Séparation par électrophorèse des isoperoxydases des céréales.

* Comparer la méthode de séparation des isoperoxydases par électrophorèse à celle effectuée à l'aide du Sephadex G100.
* Faire un schéma du zymogramme obtenu et mesurer les Rf des différentes bandes.
* Comparer les isoperoxydases de l'espèce végétale étudiée avec celles des autres espèces étudiées conjointement.
* Interpréter les résultats obtenus.

Partie 2. Peroxydase. Etude de la relation structure-fonction par visualisation tridimensionnelle à l'aide des programme Rastop et JMOL

Préambule

Le programme RasMol est utilisé dans ce travail pratique pour visualiser dans l'espace les structures enzymatiques, Afin de comprendre le mode d'utilisation, les recommandations incluses dans le CD distribué aux Etudiants, sont à prendre en considération.

Peroxydases

L'étude classique du modèle (fichier 2atj, auteurs A.Henriksen et Coll., Protein Data Bank) d'une peroxydase du raifort permet aux étudiants de découvrir la structure de l'enzyme, avec une partie non protéique plane l'hème caractérisée par la présence d'un Fe III (donc en réalité hémine et non hème) au centre d'une porphyrine. Cette structure est à rapprocher de celle des globines étudiées par ailleurs. Il y a également 2 ions Ca++

Cas de la peroxydase de plantes complexée avec un faux substrat : fichier 2atj

Title: Recombinant Horseradish Peroxidase Complex With Benzhydroxamic Acid
Compound: Mol_Id: 1; Molecule: Peroxidase C1A; Chain: A, B; Synonym: Horseradish Peroxidase C1A, Hrp C; Ec: 1.11.1.7; Engineered: Yes
Authors: A. Henriksen, D. J. Schuller, M. Gajhede
Exp.Method: X-ray Diffraction
Classification : Oxidoreductase
EC Number : 1.11.1.7 (Peroxidase)
Source: Armoracia rusticana
Primary citation: Henriksen, A., Schuller, D. J., Meno, K., Smith, A. T., Welinder, K. G., Gajhede, M.: Structural Interactions between Horseradish Peroxidase C and the Substrate Benzhydroxamic Acid Determined by X-Ray Crystallography Biochemistry 37 pp. 8054 (1998

-Le Fe III tend à établir avec son environnement immédiat 6 liaisons de coordinence avec des atomes donneurs d'électrons. Si les atomes donneurs sont à "champ fort" (ex: N), ils imposent une répartition des électrons périphériques du fer qui le rend stable. C'est le fer " bas-spin " peu réactif. Si les donneurs sont à champ plus faible (ex: O de l'eau), la répartition des électrons périphériques échappe à toute contrainte de leur part, le fer est dans un état électronique instable qui le rend très réactif: c'est le fer" haut-spin". Le fer peut également être pentacoordiné. Des techniques physiques permettent de repérer les "états" du fer.

-Ici, le Fe III établit des liaisons avec les 4 atomes d'azote de la porphyrine et avec un azote de His 170 (His proximal) situé à proximité. His 42 (His distal) situé à l'opposé est trop éloigné pour établir la sixième coordinence. Une molécule d'eau se trouve dans la zone (polaire) de la sixième coordinence. Dans la peroxydase, le fer est dans un état "haut-spin". Les étudiants peuvent restreindre l'environnement de l'hémine à His 42, Arg 38, His 170 et éventuellement H2O 999 (HOH999).

Quelques données concernant le mécanisme réactionnel

Des techniques physiques ont permis d'analyser le mécanisme complexe de la catalyse qui ne sera pas exposé ici. On peut simplement retenir que c'est d'abord H2O2 qui est attiré dans la zone polaire de la crevasse, au voisinage de His 42, Arg 38 et du Fer III. L'arrivée d'une molécule de peroxyde déplaçant la molécule d'eau distale. Une fois dans le site actif, H2O2 interagit avec des résidus d'acides aminés et l'hémine ce qui conduit à la formation d'eau d'une part et à celle d'un composé avec fer bas-spin, la sixième coordinence étant alors" bien occupée". H2O2 est réduit.
Ensuite, c'est le 2ème substrat (gaïacol par exemple) qui intervient. L'oxydation de 2 molécules de ce substrat est nécessaire pour que l'enzyme et son groupement héminique reviennent à l'état initial. Cela libère une deuxième molécule d'eau.
Le cycle catalytique fait intervenir des transferts de H+ et d'e- .

Site actif et acides aminés impliqués dans la catalyse

- L'exploitation avec RasMol du fichier 2atj permet de reconstituer un complexe peroxydase-acide benzhydrozamique. Le faux-substrat est en place dans la poche du site actif dans un environnement surtout hydrophobe, mais à proximité de His 42, Arg 38 et de l'hémine.

-Les acides aminés His 42, Arg 38 et His 170, sont conservés dans les différentes peroxydases.

-Le remplacement de certains acides aminés par mutagénèse dirigée (préparation d'un gène synthétique modifié puis exprimé dans E. Coli) complété par des études cristallographiques et/ou cinétiques fournit des renseignements sur le rôle des différents ac.aminés.

Affinité de la peroxydase pour H2O2.

Le remplacement de His 42 diminue toujours l'affinité de l'enzyme pour H2O2 et ralentit la réaction. Le remplacement de Arg 38 (polaire) par Leu 38 (apolaire) diminue également l'affinité de l'enzyme pour H2O2 et surtout pour le 2ème substrat. Ces résidus ac.aminés semblent directement impliqués non seulement dans la formation des complexes avec les 2 substrats mais aussi dans la réaction proprement dite.

Vitesse maximale (Vmax) de la peroxydase.

Le cas de Asn 70 est intéressant, son remplacement par Val 70 entraîne une baisse de Vmax de plus de 90% . Nagano et al. expliquent cela en considérant qu'entre Asn 70 et His 42 il peut y avoir une liaison hydrogène qui ne peut s'établir entre Asn 70 et His 42. Cette perte diminuerait la réactivité de His 42 et changerait sa position dans l'espace. Le modèle (2atj) en 3D ne montre pas cette liaison entre Asn et His.. On peut visualiser Asn70

Environnement du site actif

L'environnement surtout hydrophobe de l'hémine
L'hémine se trouve dans une poche limitée par des résidus ac.aminés surtout hydrophobes (zone apolaire), les seuls groupements polaires à proximité appartiennent à His 42, Arg 38 et His 170.

Le substrat est logé dans une poche dans laquelle il oriente d'une part son cycle apolaire vers la partie hydrophobe constituée par les Ac. aminés Phe179, Pro141, Ala140, Pro139, Phe 68, Gly 69 (+ une portion de l'hème) et d'autre part ses parties polaires vers His 42 et Arg 38, à proximité du fer.

Plus de détail sur la structure fonctionnelle des peroxydases étudiée par RasTop

Questions

Peroxydase de navet (complexe avec l'acide benzhydroxamique)

1/ Structure primaire :
- Nombre d'acides aminés :
<Show sequence> : 307 acides aminé par chaîne x 2 chaînes
- Acides aminés N-terminal et C-terminal : N-terminal (Gln1), C-terminal (Asn307)

2/ Structure secondaire :
- Nombre de pont S-S : <ssbonds> : 8 (= 4 x 2), ou <select cys>
- Hélices alpha : ribbons : display

3/ Positionnement de l'hème et Calcium et des acides aminés du site actif (His42 (histidine distale), Arg38 et His170 (histidine proximale)

- <select ligand>, spacefill : heme, 2 Ca et BHO353 (acide benzhydroxamique)
- <select hetero> spacefill : heme, 2 Ca, BHO353 et molecules d'eau
- mesurer distances entre His42 et Fe (Fe4779)

4/ Pourquoi BHO vient il se fixer dans la poche catalytique ?

- chaîne A en spacefill
- restrict within(10.0,BHO353)
- select bho353 + color yellow + Sticks
- write script pox_bho

5/ Comment il est orienté le BHO dans la poche catalytique ?