Enzymologie. Mécanisme de catalyse de l'Hexokinase et de la Coenzyme A transférase


En enzymologie, connaître comment les enzymes assurent la catalyse renvoie à l'élucidation de leur mécanisme, sans oublier que cela se passe par le contact du substrat avec l'enzyme à travers quelques acides aminés qui constituent le 'site actif'.
hexokinase (glucokinase) active le glucose lors de la glycolyse en le phosphorylant. Elle fonctionne selon un mécanisme séquencé (ordonné). La Coenzyme A transférase fonctionne selon un autre mécanisme, caractérisé par la formation de complexes binaire et une enzyme transitoire.


Correction de l'Exercice Hexokinase


Enoncé de l'exercice sur l'Hexokinase)
Glucose + ATP-Mg <--> Glucose 6-Phosphate + ADP-Mg
Les diagrammes primaires 1/v = f(1/(S)) en faisant varier l'ATP-Mg et en maintenant constantes les concentrations du glucose, d'une part et en variant le glucose (avec ATP-Mg constant) montrent que l'hexokinase présente une cinétique sous forme de faisceau de droites faisant intersection sur l'axe des abscisses. En enzymologie à deux substrats, cette cinétique peut informer sur la présence des mécanismes de catalyse: 1/ Mécanisme au hasard fixation indépendante et 2/ Mécanisme séquencé (ordonnée).

Enzymologie. Hexokinase
Diagramme secondaire

Les expériences de la dialyse à l'équilibre réalisées en présence de l'enzyme et un des substrat (confrontation directe) permettent de trancher sur le mécanisme de catalyse exact de l'hexokinase.
Résultats de la dialyse à l'équilibre avec ATP-Mg

(ATP-Mg) en mM (S) (ATP-Mg-Enz) en mM (RS) (RS)/(S)
0,2 0,01 0
0,5 - 0,01 0
1,0 0 0
2,0 0 0

D'après ce résultat l'ATP-Mg ne se fixe plus sur l'enzyme libre (E). Il ne peux réagir qu'avec l'enzyme préalablement complexée avec le glucose (KmATP = 0,5 mM)

Résultats de la dialyse à l'équilibre avec le glucose:

(Glucose) en µM (S) (Glucose-Enz) en µM (RS) (RS)/(S)
20 6,4 (= 26,4 - 20) 0,32
50 14,4 0,28
100 23 0,23
200 35 0,175
500 50 0,10
1000 58 0,06
2000 64 0,03

Le tracé du graphique de Scatchard (Scatchard plot) permet de déterminer la constante d'association (KA, binding constant). KA = 1/KD, KD (constante de dissociation) = 0,2 mM. Cette valeur est égale à KsGlu trouvée sur le diagramme primaire (KsGlu = 0,2 mM). Ce ci démontre que le glucose présente de l'affinité pour l'enzyme libre (E).
Le mécanisme de catalyse de l'hexokinase est un mécanisme séquencé (ordonné) avec le glucose comme substrat directeur (voir schéma de Cleland).

dialyse à l'équilibre

Calcul du nombre de site de fixation du glucose par molécule d'enzyme (hexokinase):
Dans le diagramme de Scatchard, le point d'intersection de la droite avec l'axe des abscisses corresponf à n (E), avec n = nombre de site de fixation du ligand (substrat) par molécule d'enzyme et (E) la concentration d'enzyme (ici 35 µM). n est proche de 2. L'hexokinase est sous forme de dimère.
Liensutiles: comparaison Hexokinase et Glucokinase


Correction L'exercice CoA transférase


(Enoncé de l'exercice sur la Coenzyme A transferase)
Mécanisme réactionnel de la réaction catalysée par la coenzyme A transférase:
succinyl CoA + Acétoacétate <--> Succinate + acétoacétyl CoA
Les vitesse initiales (sens de la formation du succinate comme produit) pour différentes concentrations en substrats sont données dans le tableau ci-dessous. Elles sont exprimées en nanomoles de produit apparu par minute et par mg d'enzyme.
1. Déterminer le mécanisme réactionnel de la coenzyme A transférase.
Tacés des cinétiques 1/v = f(1/(S):
Posons succinyl CoA = S, Acétoacétate = A, Succinate = S' et Acétoacétyl Co A = A'
Le tracé des diagrammes primaires 1/v = f(1/(S)), avec (A) constant et 1/v = f(1/(A)) avec (S) constant, donne des cinétiques sous formes de droites parallèles qui sont en faveur d'un mécanisme de catalyse Ping-Pong.

EnzymologiecoA-transférase


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Correction L'exercice CoA transférase (suite)

Le tracé des diagrammes secondaires des points d'intersections des droites 1/v = f(1/(S)) avec l'axe des ordonnées (points b) en fonction des inverses des concentrations en substrat maintenu constant, permet de calculer les paramètres cinétiques Km relatives aux substrats. On obtient aussi la vitesse maximale (Vmax) de la réaction.
2. Déterminer les paramètres cinétiques de cette enzyme.

Enzymologie. Diagrammes secondaires

Lors du déroulement de la catalyse, il se forment uniquement des complexes enzymatiques binaires (absence de complexes ternaires). En plus, il y'a formation d'une enzyme transitoire qui est ici E-CoA.

transférase. mécanisme ping-pong

avec S1 = Succinyl CoA, P1 = Succinate, E' = E-Co A, S2 = Acétoacétate et P2 = Acétoacétyl Co A



LIENS UTILES

- Mécanisme de catalyse à plusieurs substrats. Moyens d'étude
- Mécanisme de catalyse ping-pong
- Mécanisme de catalyse au hasard fixation indépendante
- Mécanisme ordonné (séquencé)
- Mécanisme de catalyse au hasard fixation dépendante
- Régulation enzymatique du métabolisme
- Enzymologie-enzymes (exercices)
- QCM-Enzymes. Structure et fonction (bases)
- Hexokinase
- Coenzyme Atransférase
- Amine oxydase
- Inhibiteurs. Applications
- QCM-Inhibiteurs-1
- QCM-Inhibiteurs-2.
- Phospholipase, Allostérie
- Citrate synthétase, Peroxydase (Examen)
- Chélatase, Aspartate transcarbamylase. Examen
- Enzymologie. Examen 4
- Enzymologie. Examen 5
- Polyphénoloxydase. Examen S5
- Phospholipase A2.Examen


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Enzymologie. hexokinase, transférase