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Enzymes, Enzymologie et Métabolisme. Exercices

En enzymologie, les enzymes sont associées aux activités du métabolisme. Les modulations (régulations) enzymatiques se font à travers des isoenzymes et sont caractérisées par des paramètres Km et Vmax. La spécificité (efficacité) enzymatique peut être évaluée par Vmax/Km.


Sur cette même page: Enzymes. Activité molaire --- Ks, Km & Catalytic efficiency --- Phosphatase alcaline. Specificité --- Glucokinase et efficacité catalytique --

Enzymes, métabolisme. Km, Vmax


Enzymes. Activité molaire (http://www.ac-nice.fr/):

Un enzyme purifié de masse molaire 800 000 g/mol, catalyse la transformation de S (substrat) en P (produit) avec un Km = 10-5 M. La solution d' enzyme pur, à la concentration de 150 mg/ml, est capable, si la concentration en S est de 1 x 10-2 M, de catalyser la réaction à une vitesse de 3 x 10-5 M/min.
Donnez la définition de l'activité molaire et son unité. Est-il possible de calculer l'activité molaire de l'enzyme décrite ici ? Si oui, justifiez votre réponse et ca lculez la.


Réponse

L'activité molaire (AM) d'une enzyme se calcule uniquement si l' enzyme
est pure et si on se place en conditions saturantes de substrat (v = Vmax).
AM = nombre de moles de produit formés/min/mole d' enzyme.
L'unité est donc la 1/min . Dans le cas présent on peut calculer AM car la solution d' enzyme est pure et car [S]= 1 x 10-2 M>>Km =1 x 10-5 M (facteur 1000) et donc V = 3 x 10-5 mol de P/L/min = Vmax !
AM = Vmax / nombre de mole d' enzyme.
L'enzyme catalyse la transformation de 3 x 10-5 mol de P/min pour 1 litre de milieu réactionnel. Or la concentration de l'enzyme est de 150 mg/ml donc dans 1 litre on a : 150 x 10-6 x 1000 = 0,15 g d'enzyme.
Connaissant son poids moléculaire, on peut en déduire le nombre de moles : 0,15 / 8 x 10 5 = 1,875 x 10-7 mole d'enzyme
dans un litre de milieu réactionnel. D'où AM = 3 x 10-5/ 1,875 x 10-7= 160 L/min.

Pour calculer une activité molaire, il faut : 1) Etre en conditions optimales de mesure de la vitesse de réaction (conditions saturantes en substrat ([S]>>KM) où V = Vmax et 2) Avoir une solution pure d' enzyme.

Il faut connaître la Vmax pour calculer l'activité molaire. Or [S] =1 x 10-2 M >> Km= 1 x 10-5 M (facteur 1000) donc on est en conditions saturantes de S. Cela signifie que la vitesse mesurée à cette concentration en S est la Vmax. Donc Vmax = 3 x10-5 M/min.


Enzymes, metabolisme. Comparison Ks and Km and catalytic efficiency (source: http://xray.bmc.uu.se)

Admit: E, an enzyme, S, a substrate and P, a product. The enzyme-catalysed reaction is:

 
k1
kcat
E + S
====>
<====
ES ========> E + P
 
k-1
 

a/ Ks, the [ES] dissociation constant, is frequently equated with Km. However, there is usually a difference between those values. Why? Under what conditions are Ks and Km equivalent?

b/ Why are kcat/Km values useful to describe the specificity, or preference for different substrates, of an enzyme?

Answer:

a/ Km = (k-1 + kcat)/k1, Ks = k-1/k1, Km = Ks, when kcat << k-1

b/ The kcat/Km for any given substrate tells us about the behavior of the reaction when the concentration of that substrate is low compared to Km (the usual situation in the cell). Suppose that two different substrates, A and B, are competing for binding and catalysis by the same enzyme. When the concentration of A and B are equal, the ratio of their conversion to product by the enzyme is equal to the ratio of their kcat/Km values. We can figure out why this is so: If the substrate concentration is low, the overall reaction is limited by the encounter of substrate S with the enzyme E, with the rate equation:

v0 = (kcat/Km) [E]tot [S]

In the case above [S] = [A] = [B], and so v0A/v0B = (kcat/Km)A / (kcat/Km)B

kcat/Km is therefore often called the the specificity constant.

To see that the rate equation is v0 = (kcat/Km) [E]tot [S] for low substrate concentrations, start from the MM equation: v0 = Vmax [S] / (Km + [S])

For [S] << Km this reduces to v0 = (Vmax / Km) [S]
Remember that Vmax = kcat [E]tot, so v0 = (kcat / Km) [E]tot [S] for low [S]
Start from the steady state assumption: k1 [E] [S] = (k-1 + kcat) [ES] (1)
Remember that the overall velocity of the reaction is given by v0 = kcat [ES] (2)
From (1) we get the concentration of ES: [ES] = k1 [E] [S] / (k-1 + kcat) = [E][S] / Km

Insertion of [ES] into (2) then gives v0 = (kcat/Km) [E] [S] (3)

This form of the equation is of less practical value, however, since [E] will vary with [S] in a way that also depends on the Km for S:

[E] = [E]tot - [ES]
[ES] = [E]tot [S] / (Km + [S])
[E] = [E]tot - [E]tot [S] / (Km + [S]) =
[E]tot ( 1 - [S] / (Km + [S]) ) =
[E]tot ( Km + [S] - [S] ) / (Km + [S]) ) =
[E]tot Km / (Km + [S])

Inserting this expression for [E] into equation (3) above then gives back the normal form of the MM equation.)



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Enzymes, Métabolisme. Spécificité de la phosphatase alcaline
La phosphatase alcaline est une enzyme hydrolysant les esters phosphoriques comme l'ATP ou le glucose 1-phosphate pour libérer de l'acide phosphorique libre. Le substrat le plus couramment utilisé pourdoser l'activité decette enzyme est le phosphate de p-nitrophénol. Les paramètres cinétiques pour différents substrats essayés sont résumés dans le tableau suivant:
substrat Km Vmax (µmole/min.ml)
UDP 0,025 115
ATP 0,030 121
AMP 0,032 124
Glucose 6-phosphate 0,021 116
Glucose 1-phosphate 0,024 111

Déterminer la spécificité de la phosphatase alcaline


Réponse

La spécificité est donnée par le rapport kcat/Km. Comme on ne dispose pas ici de kcat, on peut comparer les Vmax/Km. Ce rapport varie entre 3875 U/ml.mM pour l'AMP et 5523 U/ml.mM pour le Glucose-6-phosphate, en passant par 4033 U/ml.mM et 4600 U/ml.mM. Ces variations relativement sont en faveur d'une spécificité faible. En Anglais le rapport Vmax/Km est désigné 'catalytic efficiency'.

Rappel: kcat est une constante de vitesse du premier ordre (unité s-1). C’est une fréquence avec laquelle l’enzyme établit l’acte catalytique (nombre de fois par seconde) lorsqu’il est saturé par le substrat. 1/kcat est la durée, en s de l’acte catalytique (temps requis pour convertir 1 molécule de substrat en produit). kcat donne la mesure de l’efficacité de la catalyse par l’enzyme (seconde-1) ou 'Turn-over' de l’enzyme.

[Et] connue, Vmax = kcat [Et], donc kcat = Vmax/[Et]


Enzymes, Métabolisme. Glucokinase et efficacité catalytique au niveau du métabolisme
L'apparition du diabète MODY-2 (Maturity-Onset Diabetes of the Young, ou diabète de type adulte chez le jeune, est due à anomalie de la glucokinase, résultant d'une mutation du gène de la glucokinase localisé sur le chromosome 7, hyperglycémie très précoces (à jeun, entre 1,10 et 1,40 g/l (+/- intolérance au gluten). La glycémie reste inchangée pendant plusieurs décennies.

Glucokinase

L'étude cinétique de cette enzyme purifiée à partir de cellules d'un individu sain et d'un individu malade, en faisant varier la concentration en substrat (S en mM) (ici, le glucose) et en mesurant la vitesse enzymatique initiale (vi en mM/min), permis d'avoir les vitesses suivantes (les mesures sont réalisées dans un volume réactionnel final de 1 ml).

S (mM) 0,5 1,0 1,5 2,0 3,0 4,0 8,0 16,0
Individu malade, vi (mM.min-1) 0,12 0,14 0,21 0,30 0,51 0,53 0,60 0,60
Individu sain, vi (mM.min-1) 0,45 0,75 0,90 1,20 1,70 2,10 2,40 2,40

1/ Rappeler les spécificités métaboliques et les localisations tissulaires de la glucokinase et de l'héxokinase de l'Homme.

2/ Tracer les représentations de Lineweaver-Burk de la cinétique de la glucokinase pour les deux individus. Déterminer les constantes Km et Vmax.

3/ Comparer l'efficacité catalytique de la glucokinase chez les deux individus.


Réponse

Pour rappel, le diabète MODY (Maturity Onset type Diabetes of the Young) est un diabète situé entre le diabète de type I (insulino-dépendant) et le diabète de type II (non-insulino-dépendant). Selon les auteurs, le diabète MODY est classé parmi les diabètes de type II, ou mis à part.

2/ Représentation 1/v = f(1/(S)) pour la glucokinase chez un individu sain et un autre malade

Glucokinase. Sain, malade

  Km (mM) Vmax (mM.min-1) Vmax/Km
Individu malade 3,53 0,88 0,25 mM.min-1.mM-1
Individu sain 3,28 3,32 1,01 mM.min-1.mM-1

3/ L'efficacité catalytique de la glucokinase (Vmax/Km) de l'individu sain est 4 fois plus supérieure à celle de l'individu malade. Cependant l'affinité de l'enzyme pour le glucose est presque la même pour les deux individus.

Lien utiles: Glucokinase, Hexokinase, béta-galactosidase et phospholipase A2. Examen (pdf)


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