biochimie. Cours, techniques et applications en biotechnologies

Mécanismes de catalyse des réactions enzymatiques à deux substrats
ميكانزمات التفاعلات الأنزيمية بمادتين أساسيتين

Dans le cas de plusieurs substrats, le suivi de la cinetique enzymatiques permet d'élucider les mécanismes de catalyse des réactions enzymatiques à 2 substrats (ميكانزمات التفاعلات الأنزيمية بمادتين أساسيتين) catalysées par des enzymes précises. Les paramètres cinétiques correspondants sont calculés. L'effet des activateurs et des inhibiteurs reversibles sur le déroulement de l'activité enzymatique est tributaire des complexes que l'enzyme forme avec ces modulateurs.


1.6. MECANISMES DE CATALYSE ENZYMATIQUE A DEUX SUBSTRATS .... Examens ...

1.6.1. Généralités
La plupart des réactions enzymatiques impliquent 2 substrats. Le deuxième substrat peut être de l'eau pour les réactions d'hydrolyse ou un donneur ou un accepteur d'électrons pour les réactions d'oxydoréduction (coenzyme dissociable). La réaction à 2 substrats (S1, S2) et 2 produits (P1, P2) s'exprime par la relation:

S1 + S2 <--------> P1 + P2

Le mécanisme réactionnel fait intervenir plusieurs combinaisons enzyme-substrats qui peuvent être des combinaisons binaires (ES1, ES2, EP1, EP2) ou ternaires (ES1S2, ES1P2, ES2P1, EP1P2,...).
Le nombre de substrats ou de produits est indiqué par des préfixes Uni, Bi, Ter,...
Si 1s et 2P, la réaction est dite Uni-Bi. Si 2S et 2P, la réaction est dite Bi-Bi.
Deux grands types de mécanismes réactionnels sont décrits:
1. Mécanismes où l'ordre de fixation des S et des P est obligatoires (M.séquencés)
2. Mécanismes où l'ordre de fixation des S et des P n'est pas obligatoires (M.au hasard ou M.aléatoires)

Certains mécanismes sont connus par l'absence de formation de complexes ternaires et la présence d'une 'enzyme transitoire'. Ce sont des mécanismes 'Ping-Pong'
Les principaux mécanismes de catalyse enzymatiques à2 substrats sont:
Mécanismes de catalyse aléatoires.
- Mécanisme au hasard, fixation dépendante. - Mécanisme au hasard, fixation indépendante.
Mécanismes ordonnés.
- Mécanisme séquencé. - Mécanisme Theorell-Chance (Mec.Séquencé T.C).
Mécanisme Ping-Pong.


ميكانزمات التفاعلات الأنزيمية بمادتين أساسيتين

أغلبية التفاعلات الأنزيمية تستخدم مادتين أساسيتين في التحفيز. قد تكون المادة الأساسية (التفاعلية) عبارة عن الماء في تفاعلات الحلمأة أو مزود أو مستقبل للبروتونات في تفاعلات الأكسدة و الاختزال. بحضور أنزيم ما (E)، يعبر عن التفاعلات الأنزيمية بمادتين أساسيتين (S1 و S2) و ناتجين إثنين (P1 و P2) بالتوازن:

S1 + S2 <------> P1 + P2

تتضمن الميكانزمات التفاعلية عدة معقدات من أنواع أنزيم-مواد الأساس و أنزيم-نواتج قد تكون ثنائية (Complexes binaires)، مثل ES1 و ES2 و EP1 و EP2 أو معقدات ثلاثية (Complexes ternaires) مثل ES1S2 و ES1P2 و ES2P1 و EP1P2. يمكن التطرق لثلاثة ميكانزمات كبرى:

-  ميكانزمات عشوائية (Mécanismes aléatoire, au hasard) لا تتطلب أي ترتيب في ارتباط الأنزيم بمادتي التفاعل و إفراز النواتج مع تكون معقدات ثنائية و ثلاثية بين الأنزيم و مواد التفاعل و بين الأنزيم والنواتج. وحده المعقد ES1S2 يعتبر معقدا منتجا (Complexe productif). لا يمكن أبدا التكلم عن مادة الأساس الأولى أو الثانية في الارتباط مع الأنزيم و نفس الشئ بالنسبة للنواتج.

ميكانزمات مرتبة (Mécanismes ordonnés, séquencés) تتميز بنظام يطبعه الترتيب في ارتباط الأنزيم بمادتي التفاعل و ظهور النواتج مع تكون معقدات ثنائية و ثلاثية بين الأنزيم و مواد التفاعل و بين الأنزيم والنواتج. في هذه الحالة، لا بد أن ترتبط مادة التفاعل الأولى بالأنزيم حتى تمكن من ارتباط مادة الأساس الثانية و تشكيل معقد ثلاثي منتج. لهذا يصبح التنظيم ضروريا لقيام التحفيز الأنزيمي.

ميكانزمات تتميز بظهور معقدات ثنائية فقط بين الأنزيم و مواد التفاعل وبين الأنزيم و النواتج وتسمى 'ميكانزمات بينغ-بونغ' (Mécanismes ping-pong) مع ظهور أنزيم ظرفي (Enzyme transitoire). في هذه الحالة، تعتبر المعقدات الثنائية معقدات منتجة.


Les mécanismes de catalyses sont schématisés par la 'Représentation de Cleland' dont l'exemple suivant (mécanisme séquencé) illustre cette représentation.

Enzymes. Mécanismes de catalyse

La figure suivante résume les principaux types de mécanismes de catalyse des réactions enzymatiques à 2 substrats.

Enzymes. Mecamismes catalyse

1.6.2. Moyens de détermination des mécanismes de catalyse des réactions enzymatiques à plusieurs substrats.
L'étude des réactions enzymatiques à 2 S consiste à determiner l'ordre de fixation des substrats, les constantes d'affinité de chacun d'eux en présence ou en absence de l'autre et la vitesse maximale de la réaction, lorsque les 2 substrats sont en concentrations saturantes.



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Protéines et Enzymes, Baaziz 2013


1.6.2.1. Utilisation des analogues de substrats.
Une des approches permettant de déterminer l'ordre de fixation des substrats consiste à étudier le type d'inhibition par les analogues de substrats. Ces substances se comportent souvent comme inhibiteurs compétitifs des substrats dont ils sont analogues. Mais ils peuvent se comporter vis à vis de l'autre substrat comme des inhibiteurs de types différents.

Considérons le cas général où on peut imaginer toutes les possibilités de fixation.

Complexes enzymes-analogue de substrat

Utilisation d'un analogue structural de S2 (S2'). S2' peut se comporter vis à vis de S1 comme:
1/ Inhibiteur incompétitif/S1: si S2' ne peut se lier à l'enzyme qu'une fois S1 est fixé sur l'enzyme (S1 est un 'substrat directeur'). Ce type d'inhibition indique la présence d'un mécanisme séquencé (voir les types d'inhibiteurs).
2/ Inhibiteur non compétitif ou mixte/S1: si S2' (inhibiteur) peut se fixer sur l'enzyme en absence de S1. Ce type d'inhibition indique la présence d'un mécanisme au hasard (voir les types d'inhibiteurs)..

1.6.2.2. Utilisation des modes d'inhibition par les produits de la réaction (Règles de Cleland, 1963).

L'apparition des produits d'une réaction enzymatique à 2 substrats peut avoir un effet inhibiteur qui diffère selon le mécanisme de catalyse. Ces modes d'inhibition sont définis suivant les règles de Cleland (1963):

Rappelons que le mode d'inhibition peut être défini à l'aide des graphiques 1/v = f(1/(S)) en connaissant l'état des pentes des droites et l'état des intersections des droites avec l'axe des ordonnées.

Règle 1: Changement des intersections 1/v = f(1/(S)) avec l'axe des ordonnées: Un effecteur (produit d'une réaction) affectera uniquement l'intersection des droites 1/v = f(1/(S)) s'il se fixe réversiblement sur une forme enzymatique autre que celle sur laquelle s'est fixé le substrat. Cet effecteur sera un inhibiteur incompétitif.

Règle 2: Changement des pentes des droites 1/v = f(1/(S)):Un effecteur affectera uniquement les pentes des droites 1/v = f(1/(S)) s'il se fixe soit sur la même forme enzymatique que celle ayant fixé le substrat, soit sur une autre forme enzymatique que celle se combinant au substrat, mais séparée de celle ci par une ou plusieurs étapes réversibles. Cette effecteur sera un inhibiteur compétitif.
Un effecteur qui affectera à la fois les intersections des droites 1/v = f(1/(S)) avec l'axe des ordonnées et les pentes sera un inhibiteur non compétitif ou mixte.
Cas d'irreversibilité
.
Une série d'étapes réactionnelles réversibles séparant la fixation d'un substrat (S) et d'un produit (P) sera considérée comme irréversible lorsque:
1/ Les deux étapes de fixation de S et de P seront séparées par une étape d'addition d'un autre substrat dont la concentration est saturante.
2/ Les deux étapes de fixation de S et de P seront séparées par une étape de libération d'un produit dont la concentration sera considérée comme nulle (cas des mesures en vitesses initiales).
Exemple:

Soit le mécanisme séquencé suivant:

E <--+ S1--> ES1 <--+ S2--> ES1S2 <--> EP1P2 <-+ P1--> EP2 <--+ P2-->E

Inhibition exercée par P1
1/ vis à vis de S1 ((S1) variable, (S2) constante): le type d'inhibition dépend de la concentration de S2
1.1/ (S2) non saturante: P1 se fixe sur EP2, forme différente de E sur laquelle se fixe S1. L'intersection des droites 1/v = f(1/(S)) avec l'axe des ordonnées est affectée. Il existe entre P1 et S1 une série d'étapes réversibles: pente des droites 1/v = f(1/(S)) affectée. Donc, P1 est non compétitif ou mixte vis à vis de S1.
1.2/ (S2) saturante: il existe une étape irreversible entre S1 et P1 (ES1 est transformé en ES1S2). En plus, la fixation se fait sur des formes différentes (E et EP2). La pente n'est pas affectée. Seule l'intersection est affectée. P1 est incompétitif vis à vis de S1.

1.6.2.3. Utilisation d'autres méthodes. Exemple de la Dialyse à l'équilibre.
Un appareil de dialyse à l'équilibre est constitué de 2 compartiments (A et B) séparés par une membrane semi-permeable. Le compartiment A contient l'enzyme (E) (solution de concentration connue). Le compartiment B contient un analogue de substrat (S) (remplaçant le substrat car le complexe ES est souvent instable).

dialyse à l'équilibre

Seul le substrat peut diffuser à travers la membrane jusqu'à l'équilibre des activités chimique. L'équilibre est fait entre les molécules de S' libres de part et d'autre. Les molécules de S' fixées à l'enzyme n'interviennent pas dans l'équilibre. La formation d'un complexe entre l'enzyme et le substrat S' (ES') se traduit par un excès de S' dans le compartiment A. (ES') = (S')A - (S')B.


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