Enzymologie. Examen

Enzymologie. Examens

Dans l'expérience suivante, la vitesse de fixation de l'ion Co++ sur la protoporphyrine IX, a été mesurée par spectrophotométrie à différentes concentrations de cet ion et de la protoporphyrine.

Les vitesses de la réaction sont exprimées en nanomoles de complexe hème-Co++ formées par minute. Les cinétiques de la réaction déterminées en faisant varier, à chaque fois, l'un des substrats tout en maintenant l'autre substrat à une concentration constante, sont représentées par les droites 1/v = f(1/(S)) (représentations de Lineveaver-Burk) (Fig. 1 et 2).

Les différentes droites font intersection avec les axes des ordonnées en plusieurs points; bi et ci , pour les Figures 1 et 2, respectivement. On en déduit 2 diagrammes secondaires respectifs, représentés par Fig.1' et Fig.2'.

QUESTION 1 (10 points)

QUESTION 1 (12 points)

L'hydrolyse de la liaison ester en position 2 des 1,2-diacylphosphoglycérides est catalysée par la phospholipase A2. Cette réaction nécessite la présence d'ions calcium (Ca++). Pour étudier le mécanisme cinétique de cette réaction, les vitesses initiales d'hydrolyse de la dibutyryl-lécithine (DBL) ont été mesurées à différentes concentrations de ce substrat et d'ion Ca++. L'activité enzymatique est déterminée en effectuant le titrage par la soude de l'acide libéré. Les vitesses sont exprimées en µmoles d'acide libérées par min et par mg de protéine.

Les cinétiques 1/v = f(1/(S)) (représentations de Lineweaver-Burk) sont résumées dans les figures 1 (1/v = f(1/(DBL)) et 2 (1/v = f(1/(Ca++)) qui correspondent à des faisceaux de droites faisant intersection sur différents points avec l'axe des ordonnées.

Afin de confirmer le mécanisme de catalyse de la phospholipase A2, l'effet inhibiteur de l'acide butyrique (analogue structural de la DBL) a été étudié. Il permet de rendre compte que ce dernier se fixe sur l'enzyme sous forme complexée avec l'ion Ca++. Dans ces conditions, l'affinité de l'enzyme pour ce cation devient supérieure à celle obtenue en son absence. Le baryum (Ba++) (analogue du Ca++) s'est montré comme un inhibiteur compétitif vis à vis de la DBL.

1. Quels sont les mécanismes de la réaction susceptibles de rendre compte des cinétiques

représentées par les figures 1 et 2? Justifier votre réponse

2. Préciser les types d'inhibition exercées par l'acide butyrique vis à vis des substrats.

3. Interpréter l'inhibition compétitive exercée par Ba++ vis à vis de la DBL.

4. En s'aidant des types d'inhibition obtenus avec les analogues des substrats, déterminer le mécanisme de catalyse précis de la phospholipase A2.

5. Quels seraient les modes d'inhibition qu'exercent le(s) produit(s) de la réaction vis à vis des différents substrats ?

QUESTION 2 (8 points)

Répondre brièvement aux questions suivantes:

1. Quelles sont les formes d'enzymes sur lesquelles se fixent un inhibiteur compétitif et un inhibiteur mixte ?

2. Quel(s) inhibieur(s) entrainent l'augmentation de l'affinité de l'enzyme pour son substrat ?

3. Quels sont les mode d'inhibition par les produits de la réaction dans les mécanismes ping-pong et aléatoire?

4. Qu'est ce qu'une enzyme allostérique désensibilisée ?

5. Y'a-t-il un ou plusieurs sites de fixation des nucléotides sur une DNA polymérase ? Comment le prouvez vous ?

6. Quels sont les rôles des activités exonucléasiques 3' * 5' et 5' * 3', portées par les DNA polymérases des procaryotes ?

7. Quel est le rôle d'une primase ?

8. Quel est le ôle d'une RNase H ?


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Enzymologie. Examens
L'enzymologie est l'étude des mecanismes catalytiques (ordre de fixation des substrats et de libération des produits et détermination des paramètres cinétiques). Ci dessous des exemples d'études qui font l'objet d'examen. 1. ENZYMOLOGIE ..............................................................QCM Enzymologie EXAMEN (FSSM, 1e.session 2000-2001, durée: 2 heures, Coef. 1)		. QCM-Enzymes. Structure et fonction (bases) - QCM-Inhibiteurs-1 - QCM-Inhibiteurs-2. - Exercice-1 --- - Examen-1 --- Examen-2 --- Examen-3 --- Examen 4 -- Examen 5 ---
QUESTION 1 (12 points) L'hème est un groupement prosthétique existant au sein de plusieurs protéines et enzymes (myoglobine, hémoglobine, peroxydases). Il est constitué dun atome de fer (Fe++) piégé à l'intérieur d'un noyau tétrapyrrolique (porphyrine). L'insertion des ions Fe++ dans les porphyrines pour former les hèmes, est catalysée par une enzyme spécifique, la chélatase. Le Fe++ peut être substitué par l'ion Co++ ou Zn++.	Dans l'expérience suivante, la vitesse de fixation de l'ion Co++ sur la protoporphyrine IX, a été mesurée par spectrophotométrie à différentes concentrations de cet ion et de la protoporphyrine. Les vitesses de la réaction sont exprimées en nanomoles de complexe hème-Co++ formées par minute. Les cinétiques de la réaction déterminées en faisant varier, à chaque fois, l'un des substrats tout en maintenant l'autre substrat à une concentration constante, sont représentées par les droites 1/v = f(1/(S)) (représentations de Lineveaver-Burk) (Fig. 1 et 2). Les différentes droites font intersection avec les axes des ordonnées en plusieurs points; bi et ci , pour les Figures 1 et 2, respectivement. On en déduit 2 diagrammes secondaires respectifs, représentés par Fig.1' et Fig.2'. L'étude de l'interaction entre un analogue de la protoporphyrine (P') et la chélatase, en présence des substrats a permis de vérifier la fixation de P' sur l'enzyme libre et l'enzyme complexée au Co++. La constante de Michaelis pour la fixation de la protoporphyrine en présence de P' (KmP') est supérieure à celle obtenue en absence de l'analogue structural (KmP). Par contre, la constante de Michaelis (KmC') pour la fixation de l'ion Co++ en présence de P' est identique à celle trouvée en son absence (KmC). Coordonnées des points d'intersection : B : - 0,125 µM-1; C : - 0,278 µM^-1 ; D : 0,05 nmol-1.min 1/ Quels sont les mécanismes de la réaction susceptibles de rendre compte des cinétiques obtenues. Justifier votre réponse. 2/ Préciser les types d'inhibition exercées par l'analogue structural de la protoporphyrine. Justifier votre réponse. 3/ En s'aidant des types d'inhibition obtenus avec l'analogue de substrat, déterminer le mécanisme de catalyse précis de la chélatase. Justifier votre réponse.
4/ Déterminer les constantes de Michaelis des substrats et la vitesse maximale de la réaction. 5/ Quels seraient les modes d'inhibition qu'exercent le(s) produit(s) de la réaction vis à vis des différents substrats. QUESTION 2 (8 points) L'aspartate transcarbamylase est une enzyme qui catalyse la formation du carbamyl-aspartate à partir de l'aspartate et du carbamyl-phosphate
l'enzyme, extraite d'E.Coli puis traitée par un réactif chimique (PCMB), est séparée en 2 sous-unités de poids moléculaire (PM) égal à 99000, chacune et 3 sous-unités de PM égal à 34000, chacune. Les différentes sous-unités peuvent être séparées par chromatographie sur une colonne de Séphadex G-50. L'étude de l'activité enzymatique avec différentes concentrations d'aspartate a montré que les premières fractions collectées en bas de la colonne, sont très actives et montrent une cinétique représentée par la courbe 1 de la figure 1 ci-contre. Les dernières fractions collectées restent inactives. Cependant le test de l'activité des premières fractions, préalablement mélangées avec les dernières fractions a permis d'obtenir une cinétique représentée dans la figure 1 par la courbe 2. D'autre part, l'effet du CTP sur l'activité de l'aspartate transcarbamylase (enzyme native) a été testé en présence de concentrations variables et fixes d'aspartate.	Les résultats obtenus sont représentés, respectivement, par la courbe 3 de la figure 1 et la figure 2 (concentration d'aspartate fixe). Quelles conclusions pouvez vous déduire sur la structure et la cinétique de l'aspartate transcarbamylase ?
EXAMEN (FSSM, Session 2, 1998-1999, durée: 2 heures, Coef. 1) QUESTION 1 (10 points) La citrate synthétase est une enzyme qui catalyse la réaction suivante : Oxaloacétate + Acétyl-CoA ==== Citrate + CoA Les cinétiques de la réaction déterminées en faisant varier, à chaque fois, l'un des substrats (Oxaloacétate et Acétyl-CoA) tout en maintenant l'autre substrat à une concentration constante, sont représentées par des droites 1/v = f(1/(S)) (représentations de Lineveaver-Burk) qui se coupent à gauche de l'axe des ordonnées. Le Citrate exerce une inhibition compétitive vis à vis des deux substrats. L'étude de l'effet de deux composés X et Y, chacun analogue structural d'un substrat, sur la fixation de l'oxaloacétate et de l'Acétyl-CoA, a permis d'avoir 4 cinétiques différentes (voir figure ci-dessous): 1/ Quels sont les types d'inhibitions exercées par les composés X et Y vis à vis des différents substrats. 2/ De quels substrats les composés X et Y sont-ils analogues ?. Justifier. 3/ Proposer un ou plusieurs mécanisme(s) de catalyse susceptible(s) de rendre compte de toutes les cinétiques. Donner le(s) schéma(s) de Cleland correspondant(s). Question 2 ( 4 points). Les peroxydases du palmier dattier (Phoenix dactylifera L.) sont des enzymes catalysent d'oxydation des phénols (AH2) en présence du peroxyde d'hydrogène (H2O2). Le mécanisme de catalyse peut être représenté par le schéma de Cleland (voir figure ci-dessous). E' et E" sont deux formes transitoires de l'enzyme E. Comment doit on prouver la mise en jeu d'un tel mécanisme pour les peroxydases du palmier dattier ?. Question 3 ( 6 points). Répondre brièvement aux questions suivantes : 1/ En reproduisant le schéma suivant, spécifier les groupes chimiques libres (3'-OH, 5'-P,..) au niveau des sites indiqués par les flèches a, b et c lors de l'ouverture du DNA de la droite vers la gauche de la fourche de réplication (voir figure ci-dessous): 2/ Quel est le rôle du RNA dans la synthèse du DNA ? 3/ Quel serait l'effet d'une hélicase sur la vitesse et la fidélité de la réplication du DNA? 4/ Dans quel ordre ces enzymes réalisent elles la jonction de 2 fragments précurseurs de DNA (fragments d'Okazaki) ?, en partant du principe que les deux fragments sont déjà synthétisés. ........a/ DNA polymérase I (activité exonucléasique 5' 3'), DNA polymérase I (polymérisation), DNA ligase. ........b/ Primase, DNA polymérase I, DNA ligase. EXAMEN ( FSSM, 2 session 1996-97, durée: 2 heures, Coef. 1) QUESTION 1 (12 points) L'hydrolyse de la liaison ester en position 2 des 1,2-diacylphosphoglycérides est catalysée par la phospholipase A2. Cette réaction nécessite la présence d'ions calcium (Ca++). Pour étudier le mécanisme cinétique de cette réaction, les vitesses initiales d'hydrolyse de la dibutyryl-lécithine (DBL) ont été mesurées à différentes concentrations de ce substrat et d'ion Ca++. L'activité enzymatique est déterminée en effectuant le titrage par la soude de l'acide libéré. Les vitesses sont exprimées en µmoles d'acide libérées par min et par mg de protéine. Les cinétiques 1/v = f(1/(S)) (représentations de Lineweaver-Burk) sont résumées dans les figures 1 (1/v = f(1/(DBL)) et 2 (1/v = f(1/(Ca++)) qui correspondent à des faisceaux de droites faisant intersection sur différents points avec l'axe des ordonnées. Afin de confirmer le mécanisme de catalyse de la phospholipase A2, l'effet inhibiteur de l'acide butyrique (analogue structural de la DBL) a été étudié. Il permet de rendre compte que ce dernier se fixe sur l'enzyme sous forme complexée avec l'ion Ca++. Dans ces conditions, l'affinité de l'enzyme pour ce cation devient supérieure à celle obtenue en son absence. Le baryum (Ba++) (analogue du Ca++) s'est montré comme un inhibiteur compétitif vis à vis de la DBL. 1. Quels sont les mécanismes de la réaction susceptibles de rendre compte des cinétiques représentées par les figures 1 et 2? Justifier votre réponse 2. Préciser les types d'inhibition exercées par l'acide butyrique vis à vis des substrats. 3. Interpréter l'inhibition compétitive exercée par Ba++ vis à vis de la DBL. 4. En s'aidant des types d'inhibition obtenus avec les analogues des substrats, déterminer le mécanisme de catalyse précis de la phospholipase A2. 5. Quels seraient les modes d'inhibition qu'exercent le(s) produit(s) de la réaction vis à vis des différents substrats ? QUESTION 2 (8 points) Répondre brièvement aux questions suivantes: 1. Quelles sont les formes d'enzymes sur lesquelles se fixent un inhibiteur compétitif et un inhibiteur mixte ? 2. Quel(s) inhibieur(s) entrainent l'augmentation de l'affinité de l'enzyme pour son substrat ? 3. Quels sont les mode d'inhibition par les produits de la réaction dans les mécanismes ping-pong et aléatoire? 4. Qu'est ce qu'une enzyme allostérique désensibilisée ? 5. Y'a-t-il un ou plusieurs sites de fixation des nucléotides sur une DNA polymérase ? Comment le prouvez vous ? 6. Quels sont les rôles des activités exonucléasiques 3' * 5' et 5' * 3', portées par les DNA polymérases des procaryotes ? 7. Quel est le rôle d'une primase ? 8. Quel est le ôle d'une RNase H ?
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Enzymologie. Examen

L'enzymologie est l'étude des mecanismes catalytiques (ordre de fixation des substrats et de libération des produits et détermination des paramètres cinétiques). Ci dessous des exemples d'études qui font l'objet d'examen.