Peroxydase. Relation structure-fonction des enzymes.

Ce projet d'étude de la relation Structure-Fonction des molécules est consacré à la peroxydase du raifort sous sa forme complexée à l'acide benzhydrozamique, un faux-substrat (fichier 2atj, disponible sur le répertoire 'Mecules data' de ce CD).

Chaque étudiant choisira la protéine qu'il désire étudier à l'aide du programme RasTop. En exploitant les connaissances de base sur la protéine, l'étudiant préparera un compte-rendu de 4-5 pages décrivant en détail la structure de la molécule. Un index contenant au moins 3-6 images RasTop peut être joint au compte-rendu. Joindre au compte-rendu une copie des informations de base sur la molécule sujet d'étude ainsi que des références bibliographiques. Les images peuvent être fourni sous format zip et envoyées par E-mail à votre Professeur.
Le compte-rendu doit fournir les informations suivantes:
1/ Information de base sur la protéine (fonction de la protéine, son rôle, lieux de synthèse et lieu d'activité,...).
2/ structure de la protéine (nombre de sous-unités, structure secondaire,...).
3/interactions moléculaires importantes dans la fonction de la protéine (images RasTop à l'appui). Les interactions concernent, entre autres, les liaisons hydrogène et électrostatique et les interactions hydrophobes.

Les peroxydases sont des protéines héminiques
L'étude classique du modèle (fichier 2atj, auteurs A.Henriksen et Coll., Protein Data Bank) d'une peroxydase du raifort permet aux étudiants de découvrir la structure de l'enzyme, avec une partie non protéique plane l'hème caractérisée par la présence d'un Fe III (donc en réalité hémine et non hème) au centre d'une porphyrine. Cette structure est à rapprocher de celle des globines étudiées par ailleurs. Il y a également 2 ions Ca++

Cas de la peroxydase de plantes complexée avec un faux substrat : fichier 2atj
Title: Recombinant Horseradish Peroxidase Complex With Benzhydroxamic Acid
Compound: Mol_Id: 1; Molecule: Peroxidase C1A; Chain: A, B; Synonym: Horseradish Peroxidase C1A, Hrp C; Ec: 1.11.1.7; Engineered: Yes
Authors: A. Henriksen, D. J. Schuller, M. Gajhede
Exp.Method: X-ray Diffraction
Classification : Oxidoreductase
EC Number : 1.11.1.7 (Peroxidase)
Source: Armoracia rusticana
Primary citation: Henriksen, A., Schuller, D. J., Meno, K., Smith, A. T., Welinder, K. G., Gajhede, M.: Structural Interactions between Horseradish Peroxidase C and the Substrate Benzhydroxamic Acid Determined by X-Ray Crystallography Biochemistry 37 pp. 8054 (1998
---------------------------------
Les interactions structurales entre l'hémine et son environnement protéique
-L'hémine est dans une poche limitée surtout par des résidus d'acides aminés hydrophobes Phe, Ala, Gly, Ile, Leu...) mais avec His 42, His 170 et Arg 38 qui dirigent chacun leur groupement polaire vers le noyau héminique (structure JMOL des acides aminés).

-Le Fe III tend à établir avec son environnement immédiat 6 liaisons de coordinence avec des atomes donneurs d'électrons. Si les atomes donneurs sont à "champ fort" (ex: N), ils imposent une répartition des électrons périphériques du fer qui le rend stable. C'est le fer " bas-spin " peu réactif. Si les donneurs sont à champ plus faible (ex: O de l'eau), la répartition des électrons périphériques échappe à toute contrainte de leur part, le fer est dans un état électronique instable qui le rend très réactif: c'est le fer" haut-spin". Le fer peut également être pentacoordiné. Des techniques physiques permettent de repérer les "états" du fer.
-Ici, le Fe III établit des liaisons avec les 4 atomes d'azote de la porphyrine et avec un azote de His 170 (His proximal) situé à proximité. His 42 (His distal) situé à l'opposé est trop éloigné pour établir la sixième coordinence. Une molécule d'eau se trouve dans la zone (polaire) de la sixième coordinence. Dans la peroxydase, le fer est dans un état "haut-spin". Les étudiants peuvent restreindre l'environnement de l'hémine à His 42, Arg 38, His 170 et éventuellement H2O 999

Quelques données concernant le mécanisme réactionnel
Des techniques physiques ont permis d'analyser le mécanisme complexe de la catalyse qui ne sera pas exposé ici. On peut simplement retenir que c'est d'abord H2O2 qui est attiré dans la zone polaire de la crevasse (site actif, structure), au voisinage de His 42, Arg 38 et du Fer III, l'arrivée d'une molécule de peroxyde déplaçant la molécule d'eau distale. Une fois dans le site actif, H2O2 interagit avec des résidus d'acides aminés et l'hémine ce qui conduit à la formation d'eau d'une part et à celle d'un composé avec fer bas-spin, la sixième coordinence étant alors" bien occupée". H2O2 est réduit.
Ensuite, c'est le 2ème substrat, gaïacol par exemple, qui intervient. L'oxydation de 2 molécules de ce substrat est nécessaire pour que l'enzyme et son groupement héminique reviennent à l'état initial. Cela libère une deuxième molécule d'eau.
Le cycle catalytique fait intervenir des transferts de H+ et d'e- .

-L'exploitation avec RasTop du fichier 2atj permet de reconstituer un complexe peroxydase-acide benzhydrozamique. Le faux-substrat est en place dans la poche du site actif dans un environnement surtout hydrophobe mais à proximité de His 42, Arg 38 et de l'hémine.
-Les acides aminés His 42, Arg 38 et His 170, sont conservés dans les différentes peroxydases.

-Le remplacement de certains acides aminés par mutagénèse dirigée (préparation d'un gène synthétique modifié puis exprimé dans E. Coli) complété par des études cristallographiques et/ou cinétiques fournit des renseignements sur le rôle des différents ac.aminés.
Le remplacement de His 42 diminue toujours l'affinité de l'enzyme pour H2O2 et ralentit la réaction. Celui de Arg 38 (polaire) par Leu (apolaire) diminue également l'affinité de l'enzyme pour H2O2 et surtout pour le 2ème substrat. Ces résidus ac.aminés semblent directement impliqués non seulement dans la formation des complexes avec les 2 substrats mais aussi dans la réaction proprement dite.
Le cas de Asn 70 est intéressant, son remplacement par Val entraîne une baisse de Vmax de plus de 90% . Nagano et Coll. expliquent cela en considérant qu'entre Asn 70 et His 42 il peut y avoir une liaison hydrogène qui ne peut s'établir entre Val 70 et His 42. Cette perte diminuerait la réactivité de His 42 et changerait sa position dans l'espace. Le modèle (2atj) en 3D ne montre pas cette liaison entre Asn et His.. On peut visualiser Asn70

L'environnement surtout hydrophobe de l'hémine
L'hémine se trouve dans une poche limitée par des résidus ac.aminés surtout hydrophobes (materiaux-liaisons), les seuls groupements polaires à proximité appartiennent à His 42, Arg 38 et His 170.
Le substrat est logé dans une poche dans laquelle il oriente d'une part son cycle apolaire vers la partie hydrophobe constituée par les Ac. aminés Phe179, Pro141, Ala140, Pro139, Phe 68, Gly 69 (+ une portion de l'hème) et d'autre part ses parties polaires vers His 42 et Arg 38 , à proximité du fer.


Accueil --- Preambule --- Cellule --- Biochimie-materiaux --- Proteines --- Proteomique --- Enzymes --- Biologie-moleculaire & Génie génétique --- Molecules-3D-JMOL --- RasTop --- Biotechnologies-applications --- Techniques --- Techniques-videos --- QCM-exercices-examens --- Liens-utiles --- Activités-Etudiants --- Annonces --- Newsletter --- E-books --- Contact
STRUCTURE TRIDIMENSIONNELLE DE LA PEROXYDASE
Ce projet d'étude de la relation Structure-Fonction des molécules est consacré à la peroxydase du raifort sous sa forme complexée à l'acide benzhydrozamique, un faux-substrat (fichier 2atj, disponible sur le répertoire 'Mecules data' de ce CD). Chaque étudiant choisira la protéine qu'il désire étudier à l'aide du programme RasTop. En exploitant les connaissances de base sur la protéine, l'étudiant préparera un compte-rendu de 4-5 pages décrivant en détail la structure de la molécule. Un index contenant au moins 3-6 images RasTop peut être joint au compte-rendu. Joindre au compte-rendu une copie des informations de base sur la molécule sujet d'étude ainsi que des références bibliographiques. Les images peuvent être fourni sous format zip et envoyées par E-mail à votre Professeur. Le compte-rendu doit fournir les informations suivantes: 1/ Information de base sur la protéine (fonction de la protéine, son rôle, lieux de synthèse et lieu d'activité,...). 2/ structure de la protéine (nombre de sous-unités, structure secondaire,...). 3/interactions moléculaires importantes dans la fonction de la protéine (images RasTop à l'appui). Les interactions concernent, entre autres, les liaisons hydrogène et électrostatique et les interactions hydrophobes. Quelques informations sur les peroxydases Les peroxydases sont des protéines héminiques L'étude classique du modèle (fichier 2atj, auteurs A.Henriksen et Coll., Protein Data Bank) d'une peroxydase du raifort permet aux étudiants de découvrir la structure de l'enzyme, avec une partie non protéique plane l'hème caractérisée par la présence d'un Fe III (donc en réalité hémine et non hème) au centre d'une porphyrine. Cette structure est à rapprocher de celle des globines étudiées par ailleurs. Il y a également 2 ions Ca++ Cas de la peroxydase de plantes complexée avec un faux substrat : fichier 2atj Title: Recombinant Horseradish Peroxidase Complex With Benzhydroxamic Acid Compound: Mol_Id: 1; Molecule: Peroxidase C1A; Chain: A, B; Synonym: Horseradish Peroxidase C1A, Hrp C; Ec: 1.11.1.7; Engineered: Yes Authors: A. Henriksen, D. J. Schuller, M. Gajhede Exp.Method: X-ray Diffraction Classification : Oxidoreductase EC Number : 1.11.1.7 (Peroxidase) Source: Armoracia rusticana Primary citation: Henriksen, A., Schuller, D. J., Meno, K., Smith, A. T., Welinder, K. G., Gajhede, M.: Structural Interactions between Horseradish Peroxidase C and the Substrate Benzhydroxamic Acid Determined by X-Ray Crystallography Biochemistry 37 pp. 8054 (1998 --------------------------------- Les interactions structurales entre l'hémine et son environnement protéique -L'hémine est dans une poche limitée surtout par des résidus d'acides aminés hydrophobes Phe, Ala, Gly, Ile, Leu...) mais avec His 42, His 170 et Arg 38 qui dirigent chacun leur groupement polaire vers le noyau héminique (structure JMOL des acides aminés). -Le Fe III tend à établir avec son environnement immédiat 6 liaisons de coordinence avec des atomes donneurs d'électrons. Si les atomes donneurs sont à "champ fort" (ex: N), ils imposent une répartition des électrons périphériques du fer qui le rend stable. C'est le fer " bas-spin " peu réactif. Si les donneurs sont à champ plus faible (ex: O de l'eau), la répartition des électrons périphériques échappe à toute contrainte de leur part, le fer est dans un état électronique instable qui le rend très réactif: c'est le fer" haut-spin". Le fer peut également être pentacoordiné. Des techniques physiques permettent de repérer les "états" du fer. -Ici, le Fe III établit des liaisons avec les 4 atomes d'azote de la porphyrine et avec un azote de His 170 (His proximal) situé à proximité. His 42 (His distal) situé à l'opposé est trop éloigné pour établir la sixième coordinence. Une molécule d'eau se trouve dans la zone (polaire) de la sixième coordinence. Dans la peroxydase, le fer est dans un état "haut-spin". Les étudiants peuvent restreindre l'environnement de l'hémine à His 42, Arg 38, His 170 et éventuellement H2O 999 Quelques données concernant le mécanisme réactionnel Des techniques physiques ont permis d'analyser le mécanisme complexe de la catalyse qui ne sera pas exposé ici. On peut simplement retenir que c'est d'abord H2O2 qui est attiré dans la zone polaire de la crevasse (site actif, structure), au voisinage de His 42, Arg 38 et du Fer III, l'arrivée d'une molécule de peroxyde déplaçant la molécule d'eau distale. Une fois dans le site actif, H2O2 interagit avec des résidus d'acides aminés et l'hémine ce qui conduit à la formation d'eau d'une part et à celle d'un composé avec fer bas-spin, la sixième coordinence étant alors" bien occupée". H2O2 est réduit. Ensuite, c'est le 2ème substrat, gaïacol par exemple, qui intervient. L'oxydation de 2 molécules de ce substrat est nécessaire pour que l'enzyme et son groupement héminique reviennent à l'état initial. Cela libère une deuxième molécule d'eau. Le cycle catalytique fait intervenir des transferts de H+ et d'e- . SITE ACTIF ET ACIDES AMINES IMPLIQUES DANS LA CATALYSE -L'exploitation avec RasTop du fichier 2atj permet de reconstituer un complexe peroxydase-acide benzhydrozamique. Le faux-substrat est en place dans la poche du site actif dans un environnement surtout hydrophobe mais à proximité de His 42, Arg 38 et de l'hémine. -Les acides aminés His 42, Arg 38 et His 170, sont conservés dans les différentes peroxydases. -Le remplacement de certains acides aminés par mutagénèse dirigée (préparation d'un gène synthétique modifié puis exprimé dans E. Coli) complété par des études cristallographiques et/ou cinétiques fournit des renseignements sur le rôle des différents ac.aminés. Le remplacement de His 42 diminue toujours l'affinité de l'enzyme pour H2O2 et ralentit la réaction. Celui de Arg 38 (polaire) par Leu (apolaire) diminue également l'affinité de l'enzyme pour H2O2 et surtout pour le 2ème substrat. Ces résidus ac.aminés semblent directement impliqués non seulement dans la formation des complexes avec les 2 substrats mais aussi dans la réaction proprement dite. Le cas de Asn 70 est intéressant, son remplacement par Val entraîne une baisse de Vmax de plus de 90% . Nagano et Coll. expliquent cela en considérant qu'entre Asn 70 et His 42 il peut y avoir une liaison hydrogène qui ne peut s'établir entre Val 70 et His 42. Cette perte diminuerait la réactivité de His 42 et changerait sa position dans l'espace. Le modèle (2atj) en 3D ne montre pas cette liaison entre Asn et His.. On peut visualiser Asn70 ENVIRONNEMENT DU SITE ACTIF L'environnement surtout hydrophobe de l'hémine L'hémine se trouve dans une poche limitée par des résidus ac.aminés surtout hydrophobes (materiaux-liaisons), les seuls groupements polaires à proximité appartiennent à His 42, Arg 38 et His 170. Le substrat est logé dans une poche dans laquelle il oriente d'une part son cycle apolaire vers la partie hydrophobe constituée par les Ac. aminés Phe179, Pro141, Ala140, Pro139, Phe 68, Gly 69 (+ une portion de l'hème) et d'autre part ses parties polaires vers His 42 et Arg 38 , à proximité du fer.		----------------------- abc du concours d`aide soignante ou d`auxiliaire ----------------------