Quelques informations sur les peroxydases

Les peroxydases sont des protéines héminiques
L'étude classique du modèle (fichier 2atj, auteurs A.Henriksen et Coll., Protein Data Bank) d'une peroxydase du raifort permet aux étudiants de découvrir la structure de l'enzyme, avec une partie non protéique plane l'hème caractérisée par la présence d'un Fe III (donc en réalité hémine et non hème) au centre d'une porphyrine. Cette structure est à rapprocher de celle des globines étudiées par ailleurs. Il y a également 2 ions Ca++

Cas de la peroxydase de plantes complexée avec un faux substrat : fichier 2atj
Title: Recombinant Horseradish Peroxidase Complex With Benzhydroxamic Acid
Compound: Mol_Id: 1; Molecule: Peroxidase C1A; Chain: A, B; Synonym: Horseradish Peroxidase C1A, Hrp C; Ec: 1.11.1.7; Engineered: Yes
Authors: A. Henriksen, D. J. Schuller, M. Gajhede
Exp.Method: X-ray Diffraction
Classification : Oxidoreductase
EC Number : 1.11.1.7 (Peroxidase)
Source: Armoracia rusticana
Primary citation: Henriksen, A., Schuller, D. J., Meno, K., Smith, A. T., Welinder, K. G., Gajhede, M.: Structural Interactions between Horseradish Peroxidase C and the Substrate Benzhydroxamic Acid Determined by X-Ray Crystallography Biochemistry 37 pp. 8054 (1998
---------------------------------
Les interactions structurales entre l'hémine et son environnement protéique
-L'hémine est dans une poche limitée surtout par des résidus d'acides aminés hydrophobes Phe, Ala, Gly, Ile, Leu...) mais avec His 42, His 170 et Arg 38 qui dirigent chacun leur groupement polaire vers le noyau héminique.

-Le Fe III tend à établir avec son environnement immédiat 6 liaisons de coordinence avec des atomes donneurs d'électrons. Si les atomes donneurs sont à "champ fort" (ex: N), ils imposent une répartition des électrons périphériques du fer qui le rend stable. C'est le fer " bas-spin " peu réactif. Si les donneurs sont à champ plus faible (ex: O de l'eau), la répartition des électrons périphériques échappe à toute contrainte de leur part, le fer est dans un état électronique instable qui le rend très réactif: c'est le fer" haut-spin". Le fer peut également être pentacoordiné. Des techniques physiques permettent de repérer les "états" du fer.
-Ici, le Fe III établit des liaisons avec les 4 atomes d'azote de la porphyrine et avec un azote de His 170 (His proximal) situé à proximité. His 42 (His distal) situé à l'opposé est trop éloigné pour établir la sixième coordinence. Une molécule d'eau se trouve dans la zone (polaire) de la sixième coordinence. Dans la peroxydase, le fer est dans un état "haut-spin". Les étudiants peuvent restreindre l'environnement de l'hémine à His 42, Arg 38, His 170 et éventuellement H2O 999

Quelques données concernant le mécanisme réactionnel
Des techniques physiques ont permis d'analyser le mécanisme complexe de la catalyse qui ne sera pas exposé ici. On peut simplement retenir que c'est d'abord H2O2 qui est attiré dans la zone polaire de la crevasse, au voisinage de His 42, Arg 38 et du Fer III, l'arrivée d'une molécule de peroxyde déplaçant la molécule d'eau distale. Une fois dans le site actif, H2O2 interagit avec des résidus d'acides aminés et l'hémine ce qui conduit à la formation d'eau d'une part et à celle d'un composé avec fer bas-spin, la sixième coordinence étant alors" bien occupée". H2O2 est réduit.
Ensuite, c'est le 2ème substrat, gaïacol par exemple, qui intervient. L'oxydation de 2 molécules de ce substrat est nécessaire pour que l'enzyme et son groupement héminique reviennent à l'état initial. Cela libère une deuxième molécule d'eau.
Le cycle catalytique fait intervenir des transferts de H+ et d'e- .

SITE ACTIF ET ACIDES AMINES IMPLIQUES DANS LA CATALYSE

-L'exploitation avec RasTop du fichier 2atj permet de reconstituer un complexe peroxydase-acide benzhydrozamique. Le faux-substrat est en place dans la poche du site actif dans un environnement surtout hydrophobe mais à proximité de His 42, Arg 38 et de l'hémine.
-Les acides aminés His 42, Arg 38 et His 170, sont conservés dans les différentes peroxydases.

-Le remplacement de certains acides aminés par mutagénèse dirigée (préparation d'un gène synthétique modifié puis exprimé dans E. Coli) complété par des études cristallographiques et/ou cinétiques fournit des renseignements sur le rôle des différents ac.aminés.
Le remplacement de His 42 diminue toujours l'affinité de l'enzyme pour H2O2 et ralentit la réaction. Celui de Arg 38 (polaire) par Leu (apolaire) diminue également l'affinité de l'enzyme pour H2O2 et surtout pour le 2ème substrat. Ces résidus ac.aminés semblent directement impliqués non seulement dans la formation des complexes avec les 2 substrats mais aussi dans la réaction proprement dite.
Le cas de Asn 70 est intéressant, son remplacement par Val entraîne une baisse de Vmax de plus de 90% . Nagano et Coll. expliquent cela en considérant qu'entre Asn 70 et His 42 il peut y avoir une liaison hydrogène qui ne peut s'établir entre Val 70 et His 42. Cette perte diminuerait la réactivité de His 42 et changerait sa position dans l'espace. Le modèle (2atj) en 3D ne montre pas cette liaison entre Asn et His.. On peut visualiser Asn70

ENVIRONNEMENT DU SITE ACTIF

L'environnement surtout hydrophobe de l'hémine
L'hémine se trouve dans une poche limitée par des résidus ac.aminés surtout hydrophobes, les seuls groupements polaires à proximité appartiennent à His 42, Arg 38 et His 170.
Le substrat est logé dans une poche dans laquelle il oriente d'une part son cycle apolaire vers la partie hydrophobe constituée par les Ac. aminés Phe179, Pro141, Ala140, Pro139, Phe 68, Gly 69 (+ une portion de l'hème) et d'autre part ses parties polaires vers His 42 et Arg 38 , à proximité du fer.

Liste des commandes RasTop:

1) set backgroung white (passer à la couleur blanche)
2) select ligand (selection de l'heme, du faux substrat et des atomes de Ca)
3) color red (+ display spacefill)
4) restrict :a (pour étudier une seule chaîne)
5) select atomno=4779 (atome Fe de l'heme),
rappel: pour connaître les coordonnées d'un atome, pointer dessus et lire les coordonnées dans la fenêtre des commandes)
6) color blue
7) select his42:a (histidine distale de la chaîne a), (+ display bakk & stick)
8) color orange
9) select his170:a (histidine proximale de la chaîne a), (+ display ball & stick), (export GIF ..pox1 pour sauvegarder une image)
10) write script pox1script (ceci permet d'appeler ce script si vous perder l'image)
Rappel: si vous voulez revenir à cette image saisissez 'script pox1script' dans la fenêtre des commandes

Préambule / Tous les Projets/ Projet 'Hémoglobine' (Tutoriael) /Projet 'Lysozyme' /Projet 'Transaminases'/  REVENIR A LA PAGE D'ACCUEIL

,