Biochimie, biotechnologies

Enzymologie: inhibiteurs, hexokinase, coenzyme A transférase et amine oxydase

Enzymologie à 2 substrats. Exercices sur les inhibiteurs, hexokinase, coenzyme A transférase et amine oxydase


Les enzymes, catalyseurs biologiques, sont essentielles pour la vie. Leur mecanisme d'action implique le contact du substrat avec l'enzyme à travers quelques acides aminés qui constituent le 'site actif'. L'enzymologie (étude des enzymes) est l'étude des mecanismes catalytiques (ordre de fixation des substrats et de libération des produits et détermination des paramètres cinétiques). ici, des exercices sur les inhibiteurs d'enzyme, hexokinase, coenzyme A transférase et amine oxydase


Enzymologie. Exercice 1 (Inhibiteurs. Applications)

Soit une enzyme (E) qui catalyse la réaction :
A + B ===== * C + D
Soit un inhibiteur (I) de cette enzyme. En présence de E et du substrat B, I peut former un complexe ternaire. Seuls des complexes binaires sont formés en présence du substrat A , et I.
Cet inhibiteur peut être fixé de façon covalente sur gel d'agarose. On réalise ainsi une colonne de chromatographie avec l'inhibiteur couplé au support inerte.
Après passage sur la colonne d'un extrait brut bactérien contenant l'enzyme E, aucune activité enzymatique n'a été trouvée dans les fractions collectées en bas de la colonne. Le passage sur la colonne d'une solution concentrée d'un analogue structural de A (A') a permis, cette fois ci, de collecter l'enzyme.
1. Quels peuvent être les types d'inhibition exercées par l'inhibiteur I vis à vis des substrats A et B.
2. Schématiser les profils d'élution possibles. On portera en abscisses les fractions dans l'ordre de leur collection et en ordonnées les densités optiques (DO) mesurées, d'une part, à 750 nm (dosage des protéines) et d'autre part, à 420 nm (activité enzymatique).
3. Comparer les constantes de dissociation correspondant aux complexes EI et EA'.
4. Quel est l'intérêt d'une telle manipulation.
Exemple de fixation d'inhibiteur dans le cas de la * galactosidase :

Inhibiteurs: ONPTG

Enzymologie. Exercice 2 (Applications d'un inhibiteur)

On étudie la cinétique d'une enzyme qui catalyse une réaction à 2 substrats A et B.
Les vitesses initiales de la réaction, exprimées en moles de produits apparus par minute et par mole d'enzyme, ont été mesurées à différentes concentrations de substrats. Les résultats suivants ont été obtenus (tableau 'enzyme sans inhibiteur').

enzymologie

* Quels sont les mécanismes de catalyses susceptibles de rendre compte de ces cinétiques.
La même réaction a été effectuée en présence d'un analogue structural d'un des substrats (I), utilisé à une concentration de 2 mM. Les résultats suivants ont été obtenus (tableau 'enzyme en présence d'inhibiteur').
1. Déterminer le type d'inhibition exercée par I vis à vis de A et de B. De quel substrat l'inhibiteur est t-il analogue ?
2. Déterminer le mécanisme de catalyse précis et les paramètres cinétiques correspondants.
3. Retrouver l'expression de la vitesse en fonction de Ki (constante d'inhibition et de la concentration de I.
4. En déduire la valeur de Ki.

Enzymologie. Exercice 3 (Hexokinase)

Réponses brèves (Hexokinase)
On se propose de déterminer le schéma réactionnel de la réaction catalysée par l'hexokinase de levure:

Glucose + ATP-Mg <--> Glucose 6-Phosphate + ADP-Mg

Les vitesses initiales mesurées pour différentes concentrations de glucose et d'ATP-Mg sont résumées dans le tableau ci-dessous. Elles sont exprimées en µM de substrat transformé par seconde. La réaction est effectuée à pH 8,5 et à 35°C.

hexokinase

Les résultats de l'étude des inhibitions de l'hexokinase par les produits de la réaction dans le sens de la formation du Glucose-6-Phosphate et l'ADP-MG, comme produits sont représentés par les figures suivantes :

hexokinase. Enzymologie

1. Quels sont les mécanismes de catalyse de l'hexokinase susceptibles de répondre à toutes ces données cinétiques ?
2. Déterminer les paramètres cinétiques de l'hexokinase de levure ?
La fixation du glucose et de l'ATP-Mg sur l'hexokinase a été suivie par dialyse à l'équilibre. Les résultats obtenus sont résumés dans le tableaux ci-dessus:
* Que pouvez vous conclure ?
* Déterminer lorsque c'est possible, le nombre de sites et la constante de dissociation du complexe enzyme-substrat, sachant que les expériences sont réalisées à pH 8,9 et 30°C avec une concentration d'enzyme (hexokinase) égale à 35 µM.
Réponses brèves (Hexokinase)


Enzymologie. Exercice 4 (Amine oxydase)

L'étude d'une amine-oxydase du plasma de boeuf a été entreprise afin de déterminer le mécanisme cinétique de la réaction qu'elle catalyse, l'oxydation de la benzylamine :

Benzylamine + O2 + H2O <---> Benzaldéhyde + NH3 + H2O2

La réaction peut être suivie en mesurant l'augmentation de l'absorbance à 250 nm (due à l'apparition du benzaldéhyde) ou en dosant l'eau oxygénée formée.
1. On a étudié les vitesses initiales de la réaction (exprimées en unités arbitraires) pour différentes concentrations de benzylamine et d'oxygène (premier tableau):

amine oxydase

1. Déterminer le mécanisme de la réaction.
* Déterminer les constantes de Michaelis pour chacun des 2 substrats et la vitesse maximale de la réaction.
2. Par ailleurs, on a mesuré la formation de benzaldéhyde lorsqu'on a travaillé en conditions anaérobies (deuxième tableau).
* Ces résultats sont ils en accord avec le mécanisme déterminé par les études cinétiques


Enzymologie. Exercice 5 (Coenzyme A transférase)

Réponses brèves (CoA transférase)

On étudie le mécanisme réactionnel de la réaction catalysée par la coenzyme A transférase:
succinyl CoA + Acétoacétate <---> Succinate + acétoacétyl CoA
Les vitesses initiales (sens de la formation du succinate comme produit) pour différentes concentrations en substrats sont données dans le tableau suivant.


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Enzymologie. Exercice 5 sur la coenzyme A transférase (Suite)

Les vitesses sont exprimées en nanomoles de produit apparu par minute et par mg d'enzyme. La réaction est effectuée à pH 8,10 et à 25°C.

Coenzyme A transférase

Les résultats de l'étude des inhibitions par le succinate et l'acétoacétyl-Coa sont représentés dans les figures suivantes (à gauche):

CoA transférase. Exercices

1. Déterminer le mécanisme réactionnel de la coenzyme A transférase.
2. Déterminer les paramètres cinétiques de cette enzyme.


Cette enzyme (Coenzyme A transférase) a été ensuite utilisée dans 3 expériences :

Expérience 1.
l'enzyme (3,7 x 10-6 M) est incubée à pH 7,4 et 25°C en présence d'acétoacétyl-CoA à la concentration de 4,0 X 10-3 M. Le mélange est ensuite chromatographié à +4°C sur une colonne de Sephadex G-50 (1.5 X 15 cm).
Expérience 2.
L'expérience 1 est réalisée en présence d'acétoacétyl-CoA marqué au 14C sur la partie acétoacétate.
Expérience 3.
l'enzyme est incubée avec le CoA seul .
Les résultats obtenus dans toutes les expériences sont résumés dans la figure ci-dessus (à droite). La présence de l'enzyme recueillie dans les différentes fractions sortant de la colonne, est révélée par mesure de l'activité enzymatique. La présence du CoA est montrée par mesure de la radioactivité.
Une expérience analogue à la première mais réalisée en présence du succinyl-CoA à la place d'acétoacétyl-CoA, donne le même profil d'élution que celui de l'expérience 1.
*Interpréter les résultats obtenus.

CoA transférase

Expérience 4.la fraction la plus riche en CoA transférase (tube 4 de l'expérience 1), obtenue après incubation avec l'acétoacétyl-CoA suivie d'une séparation chromatographique, est mise en présence de succinate radioactif, puis chromatographiée dans les mêmes conditions que précédemment.
* Donner l'allure des profils d'élution de l'enzyme (activité enzymatique) et du CoA.
* Sous quelle forme se trouve le coenzyme A ?
Réponses brèves (CoA transférase)


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